Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
ления места расщепления рестриктаз на основе «плюс — минус» системы, предложенная Брауном и Смитом [63], практически без изменения может быть использована и в этом случае. В практике определения специфичности рестриктаз оба метода применялись одинаково успешно. В итоге можно перечислить целый ряд работ, где специфичность рестриктаз была определена при помощи этих методов [62, 67, 89, 90, 104, 161, 164, 169, 281].
Следует отметить, что метод секвенирования для определения места расщепления используется не только в упомянутом варианте (сравнение подвижности исследуемого рестрикта с фрагментами «структурной лесенки»). Он наряду с методом фингерпринтирования, применяется для определения структуры концевых последовательностей фрагментов, генерируемых исследуемыми рестриктазами [84, 85, 90, 167, 185, 281[.
Использование синтетических олигонуклеотидов. Другой методический подход, применяемый для определения места расщепления рестриктаз, стал доступен благодаря созданию эффективных методов химического синтеза олигодезоксрибонуклеотидов. Основной прогресс в этой области был связан с разработкой более совершенного фосфотриэфирно-го [256] и фосфоамидитного методов [175] и перехода от синтеза в растворе на синтез с использованием полимерных носителей [71, 175].
Процедура определения места расщепления с использованием синтетического субстрата выглядит очень просто. Для этого олигонуклеотид, содержащий сайт исследуемой рестриктазы, метится по 5'-концу при помощи Т4-полинуклеотидкиназы и [Т—32Р]АТФ, и обрабатывается исследуемым ферментом. Затем реакционную смесь анализируют при помощи ионообменной хроматографии в тонком слое ДЭАЭ-целлюлозы. В качестве маркеров параллельно разделяют продукты лимитированного гидролиза этого же меченого олигонуклеотида. Место расщепления сайта определяется путем сравнения подвижности продуктов рестрикционной реакции и лимитированного гидролиза субстрата. Очевидно, что применение этого метода возможно лишь в тех случаях, когда узнаваемая последовательность рестриктазы уже определена другими методами.
Требования, предъявляемые к длине субстрата, вероятно, могут значительно варьировать для различных рестриктаз. Для большинства ферментов достаточно синтезировать самокомпле-ментарный олигонуклеотид, в котором узнаваемый сайт фланкирован одним-двумя нуклеотидными парами. Субстраты такой длины, как правило, хорошо расщепляются большинством рестриктаз. Вместе с тем имеются также сведения, что рестриктаза Hind III не расщепляет олигонуклеотид в котором узнаваемый сайт с обеих сторон фланкирован шестизвенными последовательностями [4].
В принципе, синтетические субстраты могут применяться и в случае вырожденных узнаваемых последовательностей, а также в тех случаях, когда расщепление субстрата происходит за пределами узнаваемого участка. В первом случае место расщепления можно определить на одной из узнаваемых последовательностей, предполагая, что все остальные будут расщепляться одинаково, или можно к синтезу привлечь все варианты вырожденного субстрата. Примечательно, что для этого нет необходимости проводить много синтезов; для этого существует стратегия, позволяющая получить любой набор разных вариантов частично гомологичных последовательностей одним приемом. В тех случаях, когда имеется предварительная информация, что расщепление происходит за пределами узнаваемого участка, необходимо синтезировать олигонуклеотид с более длинными фланкирующими участками. Так как известны рестриктазы, расщепляющие субстрат на расстоянии 9, 13 и даже 16-ти нуклеотидных пар от узнаваемого участка, то длина требуемой последовательности приближается к 20—25 нуклеотидным парам. Если еще учесть, что ориентация расщепления неизвестна, то величина олигонуклеотидного субстрата удваивается. Таким образом становится ясным, что даже при наличии возможностей синтезировать олигонуклеотид такой длины может оказаться целесообразным обратиться к другим методам.
Несмотря на свою привлекательность, метод, основанный на использование синтетических субстратов для определения места расщепления рестриктаз используется относительно редко. Можно привести не так уж много примеров его применения [5, 11]. Вероятно, одной из причин являются ограниченные возможности быстрого синтеза требуемых олигонуклеотидов в лабораториях, занимающихся выделением рестриктаз. Вслед-ствии этого большинство исследователей традиционно применяют какой либо другой метод, имеющийся в арсенале лаборатории.
В заключение можно сказать, что современные методы анализа нуклеиновых кислот позволяют определить место расщепления субстрата для рестриктазы любой специфичности. Выбор стратегии и метода определения зависит от особенностей узнаваемого участка и методов, которыми владеет экспериментатор.
5. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ РЕСТРИКЦИИ-МОДИФИКАЦИИ
В настоящее время из огромного числа известных рестриктаз и метилаз, клонированы гены всего лишь 48 систем рестрикции—модификации и 26 метилаз, относящихся к системам RM (табл. 23 и 24). Развитие этого направления исследований условно можно разделить на два этапа. На первом этапе в течение довольно продолжительного времени (1978 г.)
