Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
После появления статьи Бикла с соавт. [43] ГС нашла широкое применение в схемах очистки многих рестриктаз [30, 91, 118, 130, 140, 142, 145, 146, 173, 196, 248, 249, 262, 289, 293 и др.].
В качестве лигандов для связывания рестриктаз были апробированы краситель цибакрон F3GA [32, 102], содержащий три сульфо-группы и сополимер пирана [102], представляющий собой дивиниловый эфир малеинового ангидрида, который в водных растворах гидролизуется с образованием соответствующей
поликарбоксильной кислоты, иммобилизованные на агарозе. Имеются указания, что оба эти соединения ингибируют активность рестриктаз [102]. Их структура (ароматические кольца, отрицательно зараженные группы) в какой-то мере может быть принята как имитирующая ДНК. С использованием этих сорбентов была продемонстрирована эффективная очистка ряда рестриктаз, сорбируемых непосредственно из неочищенных грубых экстрактов на голубой сефарозе [32] или на обоих обсуждаемых сорбентах после проведения стадии удаления нуклеиновых кислот [102]. В первом случае удается совместить стадию удаления нуклеиновых кислот и последующую хроматографическую очистку целевых ферментов. К недостаткам голубой се-фарозы и пирансефарозы следует отнести их низкую емкость по отношению к целевым ферментам, содержащихся в неочищенных препаратах [102].
Несмотря на довольно убедительные данные [102] об эффективности применения вышеуказанных сорбентов для очистки ряда рестриктаз, они практически не получили распространения в этой области препаративной биохимии ферментов. Хроматографическое фракционирование на голубой сефарозе было включено как одна из стадий очистки рестриктаз Mra I [289] СИ I, Gal I и Gee I [121] и при получении гомогенных препаратов Pal I [33] и Mva I [29]. Пиран сефароза нашла применение в ходе выделения функционально очищенных Nsp рестриктаз из Nostoc РСС7524 [211].
Хроматографическая очистка, основанная на истинной био-•специфической аффинности исключительно к выделяемому белку, достигается при использовании иммуносорбентов. В литературе описано применение такого сорбента для очистки рестриктазы EcoR I [9]. Авторы этой работы проводили сорбцию фермента на колонке с антителами к EcoR I, иммобилизованными на сефарозе 4В, непосредственно из бесклеточных экстрактов. В результате последующей элюции в одну стадию удалось получить гомогенный препарат фермента. Широкому применению иммуносорбентов препятствует то, что для иммунизации необходимо располагать гомогенными препаратами рестриктаз.
В завершении обсуждения применения для очистки рестриктаз сорбентов, для которых или предполагается, или действительно реализуется биоспецифическая сорбция, хотелось бы обратить внимание на ФР II. В общем случае она представляет собой катионит, содержащий присоединенные к глюкозным остаткам целлюлозы фосфогруппьг. В этом отношении этот сорбент в какой-то мере имитирует углеводно-фосфатный остов ДНК. Вопрос о движущей силе взаимодействия рестриктаз с этим сорбентом не исследован. Однако известные факты о сильном связывании фосфоцеллюлозой рестриктаз, являющихся кислыми белками, при значениях pH, значительно превышающих их изоточку [74, 120, 184, 196, 254] склоняют к предположению
об определенной роли биоспецифического взаимодействия в связывании рестриктаз с этим сорбентом.
Примеры реализации истинной гидрофобной хроматографии в ходе очистки рестриктаз, выражающейся в десорбции ферментов, связанных при высокой иониой силе, в условиях понижения концентрации солей в элюирующих растворах, немногочисленны.
В качестве гидрофобного сорбента в случае получения гомогенного препарата Bgl I [163] и функционально очищенных препаратов EcoCK I [27] и Sso47 II [18] была использована фе-нилсефароза. Элюция проводилась линейно понижающейся концентрацией сернокислого аммония. Использованная для очистки ряда рестриктаз [31, 100, 254, 303] w-аминопентилсефароза не может рассматриваться как гидрофобный сорбент, так как связывание целевых ферментов происходило только при пониженной ионной силе, а десорбция — при ее повышении. Дополнительным доводом в пользу этого утверждения являются сведения о характере взаимодействия Bgl I с фенилсефарозой [163] и w-аминопентилсефарозой [138], которое было гидрофобным в первом случае и ионообменным во втором.
Сведения о возможном участии гидрофобных взаимодействий с углеродной частью w-аминопентилсефарозы в хроматографическом фракционировании рестриктаз, описанном в цитированных выше работах, отсутствуют. Таким образом, амино-пентилсефарозу можно рассматривать как второй (после ДЭАЭц) анионит, используемый для очистки ферментов рестрикции, что расширяет возможности варьирования процедур выделения целевых ферментов.
В большинстве случаев для получения функционально очищенных препаратов рестриктаз необходимо проведение 2— 4 стадий очистки, в том числе 1—3 хроматографических. Некоторые схемы выделения оказались приемлемыми для выделения многих рестриктаз. Среди таких можно отметить схемы, включающие стадию удаления нуклеиновых кислот гельфильтрацией или путем их высаждения при помощи СС или ПЭИ, высаливание сернокислым аммонием (не во всех случаях) и последовательную хроматографию на ФРП и ДЭАЭц в указанном или обратном порядке [28, 62, 89, 90, 92, 98, 104, 122, 156, 164, 166, 167, 180, 186, 218, 219, 220, 224, 225, 247, 262, 265, 271, 294, 296, 297 и др.]. Включение в схемы выделения наряду с указанными ионитами или вместо одного из них ГС [43, 44, 68, 85, 91, 130, 145, 173, 249, 262, 282, 293 и др.,] или ГАП [17, 23, 38, 88, 105, 202, 203, 209, 288 и др.] еще более расширяет список рестриктаз, очищенных с использованием ограниченного набора сорбентов. Реже в схемы очистки включается карбоксиметилцеллюлоза [106], ДНК-агароза/целлюлоза [58, 146, 174], w-аминопентилсефароза [31, 100, 303], фенилсефароза [18, 27], голубая сефаро-за [18, 32, 102, 211, 289], гельфильтрация с использованием се-
