Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
К.С1 5.35 0.40 0.40 0.20
СаС12 1.80 0.20 0.14 0.10
MgS04•7Н20 0.83 0.20 0.20 ---
MgCl2 . 6НаО --- --- --- 0.10
NaH2P04 • НаО 1.01 0.14 --- ---
Na2HP04 • 12Н20 --- --- 0.12 * 2.90 **
кн2ро4 --- --- 0.06 0.20
NaHC03 26.10 2.20 0.35 ---
Глюкоза 5.56 1.00 1.00 ---
Феноловый красный *** --- 0.02 ---
Примечания. * — соответствует 0.06 г/л Na2HP04 • 2НгО; ** — соответствует 1.15 г/л Na2HP04 (безводный); *** — феноловый красный не является компонентом раствора Эрла, но может быть добавлен к нему.
века WI-38 оптимальны pH 7.30+0.15 и осмоляльность 285 мосмоль/кг+40 мосмоль/кг, а для фибробластов из эмбриона цыпленка — 7.12+0.18 и 300+20 соответственно [4]. С другой стороны, культивирование эпителиальных клеток из предстательной железы мыши лучше проводить в среде с 350 мосмоль/кг [5]. Оптимум pH для нетрансформированных клеток, как правило, слегка сдвинут в щелочную область по сравнению с клетками соответствующих пострянных линий.
В большинстве сред, как и в крови, в качестве главного компонента системы, поддерживающей pH, используется бикарбонат-ный буфер. В растворе бикарбоната осуществляется равновесие: НС0^=С02+0Н_. Если С02 уходит из раствора, то равновесие сдвигается вправо и пропорционально концентрации бикарбоната увеличивается число гидроксильных ионов. Растворы с бикарбонат-ным буфером можно разделить на две группы. Одни, подобно раствору Хэнкса, содержат относительно малое количество бикарбоната и предназначены для поддержания pH в плотно закрытых сосудах; в других, так же как в растворе Эрла, значительно больше бикарбоната, они используются в системах с повышенным парциальным давлением углекислого газа.
Раствор Эрла — более емкий буфер. Однако в средах на его основе культивирование можно вести в плотно закрытых сосудах лишь тогда, когда в ходе метаболизма клетки продуцируют адекватное количество СОг. В противном случае (при клонировании, например) культивирование ведут в допускающих газообмен сосудах, помещенных в СОг-инкубатор, где поддерживается заданный уровень СОг (обычно 5—10 %). Технические трудности, а также проблемы, связанные со значительными изменениями pH при манипуляциях с культурами вне С02-инкубатора, стимулируют поиск альтернативных буферных систем. Можно поддерживать pH, повышая концентрацию аминокислот .[6), а также заменяя бикарбонат р-глицерофосфатом
и различными синтетическими органическими буферами, из которых наиболее широкое распространение получил HEPES — 4-(2-окси-этил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота. HEPES (рКа=7.31 при 37 °С, молекулярная масса 238.3) легко растворяется в воде, не связывает двухвалентные катионы, не проявляет цитотоксичности вплоть до концентрации 0.05 М и обычно используется в концентрации 0.01—0.03 М [7]. Буферная емкость HEPES в отличие от бикарбоната (рК=6.1) максимальна как раз в области физиологических значений pH. Величина pKaHEPES уменьшается с ростом температуры (ДрКа/°С=—0.014), вследствие чего для получения при 37 °С pH 7.30 необходимо при 20 °С довести pH до 7.54 с помощью NaOH, концентрация которого составит более чем половину концентрации HEPES.
Добавляя к стандартным средам HEPES или другие вещества, надо учитывать их вклад в общую осмоляльность: 0.05 М HEPES с соответствующим количеством NaOH увеличит осмоляльность на более чем 75 мосмоль/кг. В результате может быть превышен допустимый предел, если одновременно не снизить концентрацию других компонентов, обычно ЫаНСОз или NaCl. Так, в случае введения 0.02 М HEPES используют бикарбонат в концентрации не более 0.01 М. С точки зрения сохранения осмоляльности следует также обращать внимание на поддержание влажности в СОг-инкубаторе, поскольку частичное испарение среды ведет к увеличению осмоляльт ности. При нормальной влажности осмоляльность контрольной среды (без клеток) остается неизменной.
Стандартные среды
В табл. 2 приведен состав некоторых наиболее распространенных питательных сред (они производятся промышленностью) и нескольких сред, оптимизированных для клеток определенного типа. Для удобства сравнения сред концентрация компонентов выражена в молях на литр. Информацию, необходимую для приготовления сред, можно найти в первоисточниках, а также в ряде обзоров [8—^ 10] (подробнее о роли отдельных компонентов сред см. [11 —13]).
Среды Игла [14]. Среда MEM (minimal essential medium) используется значительно чаще других. Подобно своей предшественнице — среде ВМЕ (basal medium, Eagle) — она основана на тщательном исследовании потребностей клеток постоянных линий, главным образом L и HeLa, содержит минимальный набор компонентов, необходимых для клеточного размножения (плюс феноловый красный в качестве индикатора pH) и предназначена для моно-слойного культивирования клеток различного типа в присутствии цельной или диализованной сыворотки. В состав МЕМ входят
