Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
В течение долгого времени, с 1943 г., существует способ подготовки посуды [1] с использованием горячей (120 °С) смеси серной и азотной кислот (16 : I).2 Новую, неиспользованную, посуду необходимо прежде всего замочить (а практически ополоснуть) в указанной смеси кислот, затем прополоскать горячей проточной водой и далее
1 Обеззараживание и стерилизацию контамннированнон микроорганизмами посуды следует по возможности производить в разных автоклавах.
2 Для мытья посуды, предназначенной для бактериологических, фармакологических и биологических исследований, не следует использовать хромовую кислоту из-за биологического действия ионов хрома [6].
--- --- --- 0.002
1.4
--- --- 1 1 0.0017
0.03
Рис. 1. Распределение оксидов в поверхностном слое тарного стекла, подвергнутого воздействию воды в течение 1 ч при 37 °С (по: [10]).
Состав: Si02 — 71.95 %, А1203 — 1 -25, СаО — 10.25, MgO — 2.5, Na20 — 13.43, КгО— 0.12, AI2O3 — 0.04 %. По оси абсцисс — глубина слоя, нм; по оси ординат — доля оксидов, % от массы.
провести цикл мытья с применением детергента с серией ополаскиваний проточной водопроводной и дистиллированной водой.
По этой методике посуду, уже использованную для культивирования клеток, необходимо предварительно проавтоклавировать, ополоснуть холодной водой и затем замочить на 24 ч в горячей смеси кислот, а затем провести все последующие этапы мытья.
Посуду, зараженную химическими канцерогенами или токсичными не физиологическими соединениями, предлагается замачивать в кислоте на 48—72 ч.
Авторы метода, естественно, напоминают, что должны соблюдаться все правила работы с кислотами (спецодежда, защитные очки, перчатки, наличие в помещении достаточного количества бикарбоната натрия для нейтрализации случайно разлитой кислоты). Они указывают, что в смеси кислот должно быть исключено присутствие тяжелых металлов. Необходимо применять кислоты марок ч. д. а., тогда для посуды из стекла «Пирекс» кислоты могут использоваться в течение длительного времени. Химический смысл указанной процедуры состоит в том, что при воздействии кислоты на боросиликатное стекло на его поверхности создается слой биоинертных поликремниевых кислот, обладающих сорбционной емкостью к белкам сыворотки, добавляемой в питательную среду. Такой защитный слой, обеспеченный составом боросиликатного стекла, может долго сохраняться; для этого достаточно однократной обработки кислотой. При таком же воздействии на многощелочное стекло, особенно с высоким (до 15 %) содержанием одного оксида, например Na+, в поверхностных слоях стекла создается слой, частично составленный поликремниевыми кислотами, в котором полностью удалены ионы Na+. Указанный слой служит в качестве защитного только ограниченное время, в пределах не более одного цикла эксплуатации, так как за счет диффузии высокоподвижных катионов Na+ из глубинных слоев стекла происходит устранение защитного слоя
3*
35
Рнс. 2. Концентрационные профили Na+ и К+ коммерческого тарного стекла, подвергнутого воздействию воды при 90 °С в течение 38, 68, 195, 540 ч (глубина разрушения достигает 6 мкм) (по: [10]).
По оси абсцисс — глубина разрушения, мкм; по оси ординат — доля оксидов,о % от массы.
и появление щелочи в около-клеточном пространстве. Последующая обработка посуды в автоклаве устраняет остаточные следы поликремниевых кислот, созданных кислотной обработкой, и обнажает стекло с высоким содержанием щелочи, контакт которого с клеткой недопустим вследствие его биоактивности. Для такого стекла необходимо кислотную обработку возобновлять в каждом новом цикле эксплуатации. Для этого можно использовать также и 2 н. НС1 и H2SO4 в течение 1—3 ч при 100 °С.
Обобщая литературные сведения и опыт, накопленный в Институте цитологии АН СССР, можно предложить определенные рекомендации по мытью стеклянной культуральной посуды: 1) обеззараживание и мытье посуды, содержащей вредные материалы, должно проводиться отдельно от других видов посуды; 2) культуральная посуда, в которой клеточные культуры были контаминированы микроорганизмами, должна предварительно пройти процедуру обеззараживания методоц автоклавирования в течение 30 мин при давлении 2 атм ;
3) для удаления остатков питательной среды с сывороткой и остатков клеток культуральная посуда после использования сразу же должна быть ополоснута холодной водой; 4) посуда должна быть вымыта по возможности вскоре после использования, а если это невозможно сделать, то ее следует замочить; 5) посуда после использования замачивается в 3—5 %-ном растворе гипохлорита натрия,3 время замачивания — не менее 1 ч, но на практике в лаборатории посуда остается в растворе на ночь (таким же действием обладает перекись водорода, 4—10 %-ный раствор); 6) посуда, обработанная смазкой или какими-нибудь жирными веществами (например, вазелином, маслом), до замачивания в гипохлорите натрия должна быть обезжирена слабым раствором углекислого натрия, ацетона или растворителями жиров, но никогда для этой цели не используются сильные щелочи; 7) после того как посуда извлечена из раствора гипохлорита ее следует несколько раз ополоснуть водопроводной водой для удаления остатков гипохлорита; 8) затем посуда моется горячей водой с детергентом; 4 процесс мытья может осуществляться как ручным
