Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
20. Rembaum A., Ingram М., Stroud-Schmink F. A., Rounds D. E. Treatment of surface to stimulate biological cell adhesion and growth // Patent USA. 1974. N 443. 751.
21. Liu S.-Ch., Eaton M. /., Karasek M. A. Growth characteristics of human epidermal keratinocytes from newborn foreskin in primary and serial cultures // In Vitro. 1979. Vol. 15. P. 813—822.
22. Hatcher V. B., Fadl-Allan N., Levitt M. A., etal. Isolation and partial characterization of endothelial cell extracellular complexes // J. Cell. Physiol. 1986. Vol. 128, P. 353—361.
23. Ham R. C,, Mosckona A. Media and growth requirements // Methods in enzymology. New York etc. 1979. P. 44—93.
24. Wahrtnann G. S. Modulation of differentiation in vitro. Influence of the attachement on myogenesis //In Vitro. 1981. Vol. 17. P. 752—763.
25. Amstein C. F„ Hartman P. A. Adaptation of plastic surfaces for tissue culture by glow charge // J. Clin. Microbiol. 1975. Vol. 21. P. 46—54.
26. Ramsey W. S., Hertl W., Nowlan E. D„ Binkowski Y. Surface treatments and cell attachment // In Vitro. 1984. Vol. 20. P. 802—808.
27. Martin G. R„ Rubin H. Effects of cell adhesion to the substratum on the growth
of chick embryo fibroblasts // Exp. Cell Res. 1974. Vol. 85. P. 319—333.
28. Curtis A. S. G., Forrester J. V., Mclnnes C., Lawrie F. Adhesion of cells to polysterine
surfaces // J. Cell Biol. 1983. Vol. 97. P. 1500—1506.
Питательные среды л
для культивирования клеток млекопитающих
А. Д. Т артаковский
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Успешное культивирование клеток вне организма возможно лишь при удовлетворении всех их многообразных и взаимосвязанных потребностей в составе жидкой (питательная среда), газообразной (смесь газов) и твердой (поверхность субстрата) фаз. Для удовлетворения уже известных потребностей клеток в питательных веществах созданы среды определенного химического состава, т. е. растворы, каждый компонент которых имеет известную химическую структуру
(хотя, конечно, даже чистейшие реактивы содержат небольшое количество примесей). Не выясненные к данному моменту потребности удовлетворяют, добавляя в среды определенного состава жидкости биологического происхождения (плазма и сыворотка крови, тканевые экстракты и т. д.).
Непостоянство чрезвычайно сложного состава и ростостимулирующей0 активности (вплоть до цитотоксичности) биологических жидкостей, воздействие, которое они оказывают на специализированные функции клеток, риск контаминации вирусами и микоплазмами создают ряд проблем при культивировании. Применение бессыворо-точных сред устраняет маскирующее влияние сыворотки и других подобных компонентов при поиске новых клеточных регуляторов и облегчает выделение полезных клеточных продуктов.
В предлагаемом обзоре рассматривается состав наиболее распространенных питательных сред, обсуждаются вопросы оптимизации сред и замены сыворотки известными веществами. В заключение описывается приготовление бессывороточной среды для культивирования нормальных кератиноцитов.
Поддержание pH и осмотического давления
Даже при кратковременном культивировании одним из главных условий сохранения жизнеспособности клеток является поддержание в определенных пределах концентрации водородных ионов (pH) и осмотического давления. Эту функцию выполняет лежащая в основе питательной среды смесь солей, дополненная углеводом в качестве источника энергии — сбалансированный солевой раствор. В табл. 1 приведен состав двух таких растворов — Эрла [1] и Хэнкса [2], которые входят в состав многих сред. Растворы Эрла и Хэнкса, а также фосфатно-солевой буфер Дульбекко и Фогта широко используются и самостоятельно, в частности, для орошения и промывания клеток, для приготовления различных растворов, необходимых при культивировании клеток: трипсина, ЭДТА, некоторых веществ, вводимых в среду, и т. д.
Осмотическое давление раствора определяется числом молей осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул) растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или на 1 л раствора (осмолярность). В разбавленных водных растворах, таких как питательные среды, эти величины близки. Общую осмоляльность раствора (осмоль/кг) можно представить в виде суммы
2 где /п,-—концентрация i-го растворенного вещества
i=i
(моль/кг), Xj— количество частиц, на которое диссоциирует его молекула, п — количество веществ. Например, для раствора Эрла (табл. 1) расчетная величина осмоляльности составит 310.6 мосмоль/ кг, а реальная, полученная из данных по определению снижения точки замерзания, — 283 мосмоль/кг [3].
Пределы pH и осмоляльности, в которых происходит размножение клеток, довольно узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Так, например, для клонального роста диплоидных фибробластов чело-
Состав сбалансированных солевых растворов
Компонент Эрла Хэнкса, г/л Дульбекко
Ю“3 М г/л
NaCl 116.50 6.80 8.00 8.00
