Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Для получения культур клеток насекомых часто берут эмбриональные клетки [10, 17, 49, 50]. В качестве примера можно привести методику получения первичной культуры эмбриональных клеток дрозофилы. Дехорионизированные гипохлоритом натрия или обработанные спиртом, а затем тщательно отмытые (см. выше) стерильные
яйца дрозофилы переносят в стерильных условиях в стеклянный цилиндр, содержащий крупноперистый стеклянный фильтр, где их
3 раза отмывают средой без сыворотки. Затем яйца переносят в стеклянный гомогенизатор и мягко гомогенизируют в питательной среде без сыворотки с помощью неплотно пригнанного пестика [ 17]. Разобщение эмбрионов на одиночные клетки лучше производить механическим способом, поскольку протеолитические ферменты не действуют на вителлиновую оболочку целого яйца [ 19]. Гомогенат эмбрионов фильтруют через стеклянный фильтр № 2 в приемник. Из 3— 120 тыс. эмбрионов 6—20-часового возраста можно получить (2—16) • 107 клеток [10, 16]. Суспензию клеток осаждают центрифугированием первый раз в среде без сыворотки при 1500 об/мин —
5 мин, второй раз — в среде с 5—15% эмбриональной сыворотки коров при 1000 об/мин — 5 мин, и осадок клеток суспензируют в свежей питательной среде с сывороткой из расчета (1—3) • 106 клеток/мл. Полученную суспензию клеток разливают в культуральные сосуды и инкубируют при 25—28 °С.
Для получения культур клеток из кусочков 20—24-часовых эмбрионов дрозофилы [51] их обрабатывают 0.2 %-ным раствором трипсина, приготовленного в солевом растворе Ринальдини [52] следующего состава (в мг на 100 мл дистиллированной воды): NaCl — 800, КС1 — 20, NaH2P04- Н20 — 5, NaHC03 — 100, глюкоза — 100, цитрат натрия — 68 и трипсин («Difco»), 1 : 250.
Была предложена камера для первичных культур эмбриональных клеток [53]. Они представляют собой склеенные силиконовой резиной два предметных стекла, верхнее стекло имеет отверстие диаметром 15 мм. Эту камеру силиконизируют и тщательно отмывают перед использованием. С помощью стеклянной палочки смазывают края лунки вазелином. Каплю суспензии клеток помещают в центр лунки, сверху покрывают покровным стеклом, предварительно тщательно отмытым от следов грязи смесью этанола и эфира (1 : 1). Вазелин герметично закрывает камеру, для этого осторожно надавливают на покровное стекло; когда капля коснется покровного стекла, она образует колонку среды в центре камеры. Камеру тут же поворачивают покровным стеклом вниз, оставляют в течение 40 мин, пока клетки не сядут и не прикрепятся к покровному стеклу. Когда же камеру переворачивают вновь, то неприкрепившиеся клетки и осколки клеток оседают на дно камеры, а прикрепившиеся клетки остаются на покровном стекле и продолжают свое эмбриональное развитие. Такая камера экономна и удобна для изучения деления и дифференцировки индивидуальных клеток при большом увеличении микроскопа и обработки их малым количеством биологически активных соединений и радиоактивной меткой.
При культивировании клеток крови насекомых (гемоцитов) [6, 54] гемолимфу получают из личинок или куколок насекомых, выращиваемых в стерильных условиях. Личинки помещают в культуральную среду и осторожно прокалывают под микроскопом их кожные покровы, в результате чего кровь выходит в среду. Клеточную взвесь (концентрация 500—1000 клеток в 1 мл) разливают в пробирки и
культивируют в роллере при 1 об/мин 5 мин. Гемоциты прикрепляются к внутренней поверхности пробирку и начинают размножаться.
С помощью методов первичного культивирования клеток удается исследовать дифференцировку и метаболизм клеток беспозвоночных в культуре [10, 11, 55]. Первичные культуры служат источником для получения длительно пересеваемых линий клеток беспозвоночных.
Линии клеток беспозвоночных. После длительного периода адаптации клеток к условиям культивирования удается проводить пересев клеток. Обычно период адаптации занимает 3—10 мес от момента эксплантации клеток в первичную культуру. В настоящее время получен целый ряд пересеваемых линий клеток из различных тканей, взятых на разных стадиях развития беспозвоночных животных (см. обзор: [1]).
Пассирование клеток детально описано на примере линии эмбриональных клеток дрозофилы [56]. В наших условиях ведения линий клеток дрозофилы Drosophila melanogaster, D. virilis, комаров Aedes aegypti, A. albopictus, тутового Bombyx mori и дубового Antheraea pernyi шелкопрядов и непарного шелкопряда Lymanthria dispar активный рост клеток всех линий отмечен на среде КШ-10 с добавлением сыворотки или без нее при 25—28 °С. Пересев клеток производят с интервалом 7 сут в разведении от 1 : 5 до 1 : 40 в зависимости от активности их роста. Для этого засевают в пластмассовые 40 мм чашки Петри однократного пользования (Ленинградский завод медицинских полимеров, ТУ-64-2-19-79) суспензию клеток в объеме 2 мл среды КШ-10, содержащей 0—15% эмбриональной сыворотки коров, концентрация клеток (0.5—1) • 10® на 1 мл. Предварительную обработку трипсином никогда не проводили, а для снятия клеток с поверхности сосуда достаточно осторожно суспензировать клетки в старой питательной среде и перенести их в свежую среду (например, 1 каплю суспензии переносят в чашку с 2 мл питательной среды, чтобы получить разведение 1 : 40; 2 капли — на 2 мл, 1 : 20 и т. д.). Посеянные клетки осторожно суспензируют и инкубируют в СОг-инкубаторе, содержащем 5 % СОг и 95 % воздуха. Таким путем нам удалось непрерывно пересевать диплоидную линию эмбриональных клеток дрозофилы 67j25D в течение 19 лет, что равно примерно 950 пассажам или 3800 клеточным поколениям.
