Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Культивирование каллусных тканей
Каллусной тканью или штаммом культуры изолированных клеток высшего растения называется ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации из эксплантатов органов растений после первого субкультивирования [9]. Как правило, исходный эксплантат гетерогенен по морфологическому, физиологическому и цитогенетическому состоянию, и неизвестно, какне именно клетки, дедифференцн-руясь, дают начало культуре, т. е. возникновение штамма с индивидуальными признаками носит вероятностный характер. В дальнейшем, после возникновения штамма, происходит его становление, приводящее к формированию популяции клеток, приспособленных к росту в условиях in vitro. Продолжительность этого периода у разных культур неодинакова и приблизительно составляет 100—200 сут, в течение которых происходит 8—10 циклов роста. Затем, наступает период относительной стабилизации штамма на определенном физи-олого-биохимическом и цитологическом уровнях. Однако и в этот период сформированного штамма у большинства изученных-объектов наблюдается изменчивость культивируемых клеток, характеризующаяся в цитогенетическом отношении увеличением числа хромосом и хромосомных аберраций. Этим объясняют и уменьшение с возрастом культуры ее морфогенетической способности.
Изменчивость растительного генома in vitro зависит от тканевого происхождения исходного эксплантата, состава питательной среды и других условий выращивания, однако определяющим моментом является генетическая конституция вида [10]. Сохранение видовых свойств проявляется прежде всего в биосинтезах специфических вторичных соединений. Значительно менее ясно, в какой мере сохраняются в культуре особенности основного обмена исходного растения, поскольку клетки in vitro обладают большой метаболической подвижностью и способны использовать альтернативные пути метаболизма, т. е. может реализоваться самая разная степень соответствия изучаемых признаков особенностям исходного растения. Довольно часто обнаруживается сохранение определенных физиолого-биохимических характеристик исходных тканей в качественном отношении при изменении их количественного выражения. Сохранение исследуемого признака на уровне исходного и в количественном отношении наблюдается редко, по-видимому, из-за отсутствия коррелятивных связей целого растения, что значительно меняет обмен в клетках. Кроме того, в ряде случаев отмечалась радикальная перестройка метаболизма, определяемая по активности ферментов превращения энергии и азотного обмена, ряда гидролитических ферментов, а также по синтезу и накоплению запасных продуктов. Формирование индивидуального штамма является зачастую невоспроизводимым процессом,
зависящим от многих факторов, связанных с особенностями исходного материала и условиями культивирования клеток.
Техника культивирования каллусных тканей. Большинство эксплантатов образуют первичный каллус, который можно субкультиви-ровать, через 6—8 нед. В асептических условиях каллус следует перенести пинцетом в стерильные чашки Петри, скальпелем отделить каллусную ткань от исходного эксплантата или некротических участков в центре и на нижней стороне каллуса и, разделив каллус на несколько кусочков (5X5 мм), перенести на свежую питательную среду. '.Рекомендуется положить кусочек срезанной поверхностью на агар и осторожно прижать его к среде. Использованные пинцеты и скальпели опускаются в 96 %-ный спирт и в процессе работы обжигаются в пламени спиртовки и остужаются между листами стерильной бумаги.
Обычно каллусную ткань субкультивируют через каждые 4 нед. Визуальные наблюдения за состоянием культур необходимо проводить н-е реже 1 раза в неделю. В случае интенсивного роста каллусы надо пересадить раньше (через 3 нед), не допуская обезвоживания и потемнения ткани.
Если при пересадках выявляется инфекция, необходимо тщательно проанализировать все этапы работы. По наличию отдельных очагов грибковой инфекции на поверхности среды можно судить
о неблагополучии со стерилизацией помещения или ламинар-бокса, поскольку такая инфекция заносится воздушным путем. Если выявляется бактериальная инфекция вокруг эксплантата или каллуса в питательной среде, то инфекция могла быть занесена с клетками и такой рас*гительный материал должен быть отбракован. Такого же рода инфекция может быть занесена плохо простерилизованными инструментами или чашками Петри. Наличие бактериальной инфекции внутри среды может говорить о плохой стерилизации питательной среды при автоклавировании.
Литература
1. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М., 1964. 272 с.
2. Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. М., 1983. 96 с.
3. Шамина 3. Б. Методические указания по клеточной селекции (ВАСХНИЛ). М.,
1984. 36 с.
4. Gamborg О. L., Eveleigh D. Е. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and baHey // Canad. J. Biochem. 1968. Vol. 46, N 5. 417—421.
5. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, N 13. P. 473—497.
