Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Концентрированные растворы витаминов готовят также с расчетом добавления 1 мл на 1 л среды, они должны быть разлиты по 10 мл и заморожены при —20 °С. Фитогормоны приготавливают в небольших количествах (10—20 мл) и хранят при 4 °С.
Ауксины (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота — 2,4-Д, индолил-уксусная кислота — ИУК, 1-нафтилуксусная кислота, индолилмасля-ная кислота и др.) и цитокинины (б-бензиламинопурин, кинетин, зеатин, 2-изопентенил-аденин) обычно используются в концентрации 10~7—10-5 М. Эти фитогормоны растворяют в нескольких каплях водного этанола или 1 н. NaOH и далее доводят до нужного объема бидистиллятом. Гиббереллин (GA3) легко растворим в воде.
Агар-агар пластинчатый моют несколько часов в проточной водопроводной воде, ополаскивают 2—3 раза дистиллированной водой, отжимают в марле и высушивают под вентилятором.
Для приготовления 1 л твердой питательной среды взвешивают
7 г агара и растворяют его при подогревании в 500 мл бидистиллята. Если агар-агар загрязнен механическими примесями, его фильтруют через двойной слой марли.
С помощью цилиндра и пипеток отбирают концентрированные растворы макросолей, микроэлементов, хелатного железа, витаминов,
фитогормонов и помещают их в химический стакан на 1 л. Добавляют к смееи навески мезоинозита, сахарозы и других сухих органических компонентов (желательно растворить их по отдельности в бидистилляте). Бидистиллированной водой объем доводят до 500 мл. Осадок можно растворить, перемешивая раствор на магнитной мешалке или слегка подогревая его на плитке. Далее следует довести pH до оптимума, зависящего от особенностей культуры (5.4—6.2), добавляя по каплям 1 н. NaOH или НС1 (обычно после автоклавирования pH среды несколько понижается). Добавляют расплавленный агар, доводят в цилиндре объем до 1 л, хорошо перемешивают и быстро разливают в чистые пробирки или колбы (можно использовать автоматические дозаторы, осуществляющие подогрев и перемешивание среды). Колбы закрывают ватными пробками, кладут этикетку, накрывают целлофаном и затягивают пробку резинкой. Можно закрыть колбы вместо пробок плотной фольгой. Колбы со средой стерилизуют
15 мин в автоклаве при 0.7—0.8 атм с предварительным прогревом под давлением 0.7 атм при открытом кране в течение 15 мин. Время стерилизации определяется объемом среды в колбе: 20—150 мл — не менее 15 мин, 200—500 мл — 25 мин.
Автоклавированную среду, содержащую ауксины, лучше использовать сразу; если среду необходимо хранить продолжительное время, ее помещают в холодильник при 2—4 °С.
Большинство каллусных культур хорошо растет на полностью синтетических средах. Однако некоторые культуры растут лучше в присутствии гидролизата казеина, дрожжевого экстракта, кокосового молока или экстрактов растений. Кокосовое молоко или экстракты плодов, отфильтрованные через бумажный фильтр, разливают в ампулы и автоклавируют, затем ампулы запаивают и хранят при —20 °С. Добавляют к среде 10—15 % от объема.
Некоторые фитогормоны, например гибберелловая кислота и зеа-тин, а также активные вещества иного рода (аминокислоты) термолабильны и их нельзя автоклавировать. В таких случаях готовят среду без этих веществ, автоклавируют ее, охлаждают до 50 °С, добавляют в стерильных условиях термолабильный компонент, просте-рилизованный через бактерицидный фильтр (размер пор 0.45 мкм) и быстро разливают по пробиркам или колбам.
При выращивании без агара каллусные культуры можно высаживать на мостики из фильтровальной бумаги, которые при пересадке погружаются в жидкую питательную среду после автоклавирования либо в колбы на диски из пенополиуретана (поролона). Предварительно диски отмывают мылом, хорошо промывают водой, автоклавируют в дистиллированной воде, отжимают и затем, погрузив в питательную среду, вновь автоклавируют. Диски можно использовать многократно. Можно использовать также пластмассовые шарики, стеклянные бусы, ПААГ.
Стерилизация исходного материала
Каллусные культуры могут быть получены из разных органов и тканей растений (листьев, стеблей, корней, цветоносов, частей
Цветка) и даже таких специализированных тканей растений, как эндосперм семян или микроспоры, изолированные из пыльников. Способность к инициации каллуса в условиях in vitro у молодых, ювенильных, растений выше, чем у зрелых. В случае специализированных тканей, например эндосперма, образование и рост каллуса зависят от возраста семени. Как правило, каллус с трудом образуется на эксплантатах старше 8—11 сут после опыления. Отрезки стеблей древесных растений обычно являются плохими эксплантатами. Иногда используют такой прием: срезают боковую ветвь, давая возможность образоваться раневому каллусу прямо на растении, затем каллус изолируют, стерилизуют и помещают на стерильную питательную среду.
Следует заметить, что для успешной инициации первичного каллуса в питательную среду часто необходимо вводить антиоксиданты (глютатион — 5 мг/л, диэтилдитиокарбамат — 5, цистеин — 5, аскорбиновую кислоту — 10, поливинилпирролидон — 250—500 мг/л и др.), которые будут ингибировать ферменты, окисляющие фенолы. Продукты окисления фенолов токсичны и подавляют деление клеток эксплантата.
