Практикум по гистологии, цитологии и эмбриологии - Юриной Н.А.
ISBN 5-209-00126-1
Скачать (прямая ссылка):
Люминесцентная микроскопия. Предметом изучения в люминесцентной микроскопии является фотолюминесценция гистологических структур, возбуждаемая электромагнитным излучением видимой или ультрафиолетовой области спектра. Поэтому в люминесцентных микроскопах в качестве источника света используются ртутные лампы.
Различают два вида флюоресценции: собственную и наведенную. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоресценцией, однако она обычно бывает чрезвычайно слабой. Наведенная (вторичная) флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями— флюорохрома ми. Их концентрация настолько мала, что они не влияют на состав и структуру препарата, а также не нарушают жизнедеятельность биологических объектов. Это дает возможность с помощью люминесцентной микроскопии проводить прижизненное микроскопическое исследование. Люминесцентный анализ — очень чувствительный метод исследования, позволяющий определять химический состав отдельных элементов структуры, их химические превращения, количество тех или иных компонентов и т. д.
Ультрафиолетовая микроскопия. В ультрафиолетовых микроскопах используется излучение ультрафиолетовой области спектра, длина волны которого вдвое меньше длины волны видимого света. Благодаря этому разрешающая способность ультрафиолетового микроскопа в 2 раза выше, чем у обычного светового.
В основе ультрафиолетовой микроскопии лежит избирательное поглощение биологическими тканями и клетками коротковолнового излучения, вследствие чего микроскопирование ультрафиолетовых изображений позволяет увидеть их структуру, Преобразование невидимого изображения, формируемого УФ-микроскогюм, в видимое осуществляется с помощью флюоресцентного экрана.
Электронная микроскопия
Электронные микроскопы в настоящее время обладают самой высокой разрешающей способностью, которая обусловлена очень небольшой длиной волны электромагнитных колебаний потока электронов, используемых в приборе. При употреблении высоких ускоряющих напряжений (при разности потенциалов около 50 ООО вольт) длина электромагнитной волны может составлять приблизительно 0,005 нм, а разрешающая способность — 0,0025 нм %
(—). Таким образом, в электронном микроскопе теоретически возможно
2
повышение разрешающей способности и соответственно увеличения изображения в 100 000 раз большее по сравнению со световым микроскопом.
Практически лучшие современные электронные микроскопы имеют разрешающую способность ОД—0,3 им, что позволяет исследовать все ультра-структуры клетки на молекулярном уровне. При этом достигается увеличение объекта до 150 000 раз. Направление движения и фокусировка потока электронов производятся с помощью электромагнитных линз, которые играют роль объектива и окуляра, в результате чего достигается эффект прохождения лучей, аналогичный их прохождению в световом микроскопе.
Конечное увеличенное изображение объекта формирует проекционная линза, его невозможно увидеть глазом, так как длина волны электромагнитных колебаний лежит далеко за пределами видимой части спектра. Поэтому изображение проецируется на экран, покрытый люминофором. Поток
электронов, взаимодействуя с люминофором, вызывает свечение, лежащее уже в видимой части спектра.
Наиболее часто в морфологических исследованиях используются просвечивающие электронные микроскопы, позволяющие получить плоскостное изображение изучаемого объекта. В последние годы активно применяют растровые (сканирующие) электронные микроскопы, способные создавать трехмерные изображения, т. е. получать пространственное изображение структур..
Техника микроскопирования в электронном микроскопе состоит в следующем:
1. Препараты (срезы на сеточках) помещают в специальный объектодержатель в электронном микроскопе.
2. С помощью регулировочных винтов устанавливаются увеличение, фокус, максимальная освещенность объекта, что контролируется просмотром изображения на люминесцирующем экране.
3. Перемещая образец, находят интересующую исследователя ультраструктуру.
4. Объект фотографируется на микрофотопластинки (или фотопленки), помещенные в специальные кассеты (магазин).
5. Электронные микрофотографии, полученные с этих пластинок, являются объектом, по которому изучаются ультраструктуры.
Цель занятия — овладение методами световой и электронной микроскопии гистологических объектов.
Задачи: 1. Ознакомиться с устройством и принципом работы различных световых микроскопов.
2. Овладеть техникой микроскопирования гистологических препаратов в световых микроскопах.
3. Ознакомиться со специальными методами исследования гистологических препаратов: сравнительная, фазово-контрастная, люминесцентная и ультрафиолетовая микроскопия.
4. Ознакомиться с принципами работы электронного микроскопа и особенностями микроскопирования в нем микрообъектов.
Необходимый исходный уровень знаний: 1. Световой микроскоп, его устройство, основные характеристики.
2. Методы фазового контраста, люминесцеитйой и ультрафиолетовой микроскопии.
