Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Частота резонансно поглощаемых радиоволн в ЯМР зависит как от типа изотопа, так и от напряженности магнитного поля. Обычно при получении спектров; ЯМР частоту радиоволн поддерживают постоянной, а меняют напряженность магнитного поля. Поэтому спектр ЯМР, как правило,— это зависимость поглощенной энергии от напряженности магнитного поля, а не от длины волны или частоты. Диапазон изменения напряженности магнитного поля мал по сравнению с самой напряженностью. Таким образом, спектр характеризуют две величины: частота поглощаемых радиоволн и напряженность магнитного поля. В ПМР-спектроско-пии обычно используют радиоволны частотой 40 МГц.
Истинная напряженность магнитного поля, в котором находится ядро, зависит от его окружения и отличается от напряженности, создаваемой внешним электромагнитом. Это обусловлено тем, что при движении электронов, окружающих атомное ядро, создаются локальные магнитные поля, напряженность которых составляет (15—20)-10“* Т. Когда равнодействующая локальных магнитных полей направлена против внешнего поля, эффективная напряженность поля у каждого ядра будет ниже, чем внешнее магнитное поле. В этом случае говорят о диамагнитном экранировании. Экранирование тем слабее, чем сильнее притягиваются электроны соседними ядрами* В том случае, когда результирующая локальных полей направлена по внешнему полю, резонансный переход происходит при меньшем значении напряженности поля, поэтому говорят
о дезэкранировании. В результате резонанс одних и тех же ядер в разных химических группах наблюдается при разных частотах, их полосы смещены одна относительно другой. Это смещение измеряется относительно сигнала некоего стандартного соединения и называется химическим сдвигом. В ПМР-спектроскопии в органических растворителях таким стандартным спектром является сигнал сильно экранированного протона тетраметилсилана, Si(CH3)4, а в водных растворах используют триметилсилилпропансульфонат
(СН3)3 SiCH2CH2S03—Na+.
Химический сдвиг выражается обычно в безразмерных единицах — миллионных долях. Шкала самых современных спектрометров прокалибрована в единицах т. По этой шкале пик Si(CH3)4
176 Часть III. Аналитические методы
наблюдается при т = 10, т. е. основные сдвиги происходят между т = 0 и т = 10. По спектрам ЯМР удается различить, например, следующие положения протонов:
щ—о—, *н—dH; щ—сн2.
\
По интенсивности пиков, т. е. по их площади можно оценить относительное число протонов ХН в каждой химической группе.
Спектры ЯМР отражают также спин-спиновое взаимодействие ядер через их электронные оболочки. Это взаимодействие на спектрах ЯМР, уже разделенных из-за химического сдвига, проявляется как сверхтонкое расщепление. Для разрешения пиков сверхтонкой структуры нужны магниты с сильным полем. Как и спектры ЭПР, спектры ЯМР широко применяются для анализа химических структур. Величина химического сдвйга позволяет идентифицировать отдельные химические группы соединения, а интенсивность линий спектров ЯМР дает количественное соотношение таких групп. Сверхтонкая структура спектров ЯМР содержит информацию об окружении ядер, а величина сверхтонкого расщепления позволяет выяснить пространственное расположение различных групп в молекуле. Но как и спектры ЭПР и инфракрасные спектры, ЯМР-спект-ры очень сложны, и их анализ требует кропотливой и тщательной работы.
5.8.2. Оборудование
На рис. 5.12 схематически изображено устройство спектрометра ЯМР. Для создания постоянного магнитного поля напряженностью 1—10 Т используются электромагниты весом 108—104 кг, стабильность которых лучше 0,1%. Для изменения магнитного поля в пределах 10-2 Т применяют дополнительный свип-электро-
Рис. 5.12. Схема устройства спектрометра ядерного магнитного резонанса.
/ — источник радиоволн; 2 — образец; 3 — основной магнит; 4 — свип-магнит; 5 — радиоприемник; 6 — усилитель; 7»—самописец; 8 —свип-генератор.
Гл. 5. Спектроскопические методы 177
магнит. В качестве источника электромагнитных колебаний используется радиочастотный источник. Образец в высокой концентрации растворяют в растворителе, не содержащем протонов, например D20 или CDC13. Для сведения к минимуму влияния колебаний магнитного поля образец помещают в трубку очень точного размера и быстро вращают ее. Поглощение регистрируется радиоприемником, усиливается и записывается на самфшсце.
Для расшифровки сложных спектров ЯМР применяются вычислительные машины, в которые вводят данные по 101—103 спектрам одного и того же образца. Машина эти данные сравнивает и дает средний спектр. Такие ЭВМ-приставки незаменимы при исследовании слабопоглощающих биологических образцов.
5.8.3. Применение
ЯМР-спектроскопия используется в основном для изучения структуры относительно простых органических молекул. Так, при помощи ЯМР удалось исследовать структуру антибиотиков, грамицидина и валиномицина и связать ее с их биологической функцией. С помощью ЯМР-спектроскопии были исследованы влияние аламетицина и холестерина на подвижность лецитина в искусственных и эритроцитарных мембранах, а также относительная подвижность различных частей боковых цепей жирных кислот лецитина в двойном липидном слое. Последнее получено с помощью введения в лецитин в различные положения 18F и 13С.
