Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Цельный гомогенат ..... 121 1 100 0,175 2100
Ядра ............ 30 1 80 0,12 320 15,64
Митохондрии ........ 21,5 1 200 0,12 621 30,36
Лизосомы.......... 16,5 1 100 0,076 139 6,81
Микросомы ......... 21 1 100 0,17 397 19,38
Супернатант......... 287 1 25 0,07 568 27,78
Стандартный белок ..... --- 0,09 --- ---
2045 100
Расчет относительной удельной активности-.
Выход активности во фракциях. Выход белка во фракциях, % 6,99
Ядра: JI изосомы: Супернатант:
15,64
32,17
6,81
13,61
27,78
= 0,45 = 4,74 = 0,49
Митохондрии:
Микросомы:
37
30,36
10,23
19,38
= 1,22 = 0,53
Рис. 2.7. Распределени е р -глицерофосфатазы в субклеточных фракциях, выделенных из печени крысы, по данным, полученным с помощью дифференциального центрифугирования.
58 Часть II. Методы разделения
2.7. Фракционирование методом
дифференциального центрифугирования. Оформление результатов
Результаты, полученные при фракционировании тканей, удобнее всего оформлять в виде графиков. Так, при исследовании распределения ферментов в тканях данные лучше всего представлять в виде гистограмм, дающих возможность визуально оценить результаты проведенных экспериментов.
Рис. 2:8. Распределение Р-глицерофосфатазы в субклеточных фракциях, выделенных из печени крысы.
Я — фракция ядер; М — фракция митохондрий; JI — фракция лизосом; П — фракция мик-росом; С — конечный супернатант.
Ферментативную активность^ содержание белка в пробе определяют как в исходном гомогенате, так и в каждой выделенной субклеточной фракции в отдельности. Суммарная ферментативная активность и содержание белка во фракциях не должны сильно отличаться от соответствующих значений в исходном гомогенате.
Затем проводят расчет ферментативной активности и содержания белка в каждой фракции в % от общего выхода (рис. 2.7), на основании чего составляют гистограмму (рис. 2.8). По оси абсцисс последовательно откладывают относительное количество_ белка в каждой фракции в порядке их выделения, а по оси ординат — относительную удельную активность (ОУА) каждой фракции. Таким образом, по площади столбиков определяют ферментативную активность каждой фракции (в %).
Гл. 2. Центрифугирование 59
2.8. Аналитическое ультрацентрифугирование
В отличие от препаративного центрифугирования, целью которого является разделение веществ и их очистка, аналитическое ультрацентрифугирование применяется в основном для изучения седиментационных свойств биологических макромолекул и других структур. Поэтому в аналитическом центрифугировании применяют роторы и регистрирующие системы особой конструкции: они позволяют непрерывно наблюдать за седиментацией материала в центробежном поле.
Аналитические ультрацентрифуги могут развивать скорость до 70 000 об-мин-1, создавая при этом центробежное ускорение до 500 000 g. Ротор у них, как правило, имеет форму эллипсоида и соединен посредством струны с мотором, что позволяет варьировать скорость вращения ротора. Вращается ротор в вакуумной камере, снабженной'холодильным устройством, и имеет две ячейки, аналитическую и балансировочную, которые устанавливаются в центрифуге строго вертикально, параллельно оси вращения.
Балансировочная ячейка слу- 1
г
4h~
з
-о-
жит для уравновешивания аналитической и представляет собой металлический блок с прецизионной системой. В ней имеются также два индексных отверстия, находящиеся на строго определенном расстоянии от оси вращения (рис. 2.9), с помощью которых определяют соответствующие расстояния в ана-
и-
13
12
а.
ж
5
11
I I
<i>-J I
zb9
п?
-ю
Аналитическая ячейка
Рис. 2.9. Схематическое изображение системы для аналитического ультрацентрифугирования (а) н аналитической и балансировочной ячеек (б).
/ — мотор; 2 — зеркало; 3 — линза; 4 — фотопластинка; 5 — окуляр; 6 — гибкий вал; 7 — положение аналитической ячейки; 8 — камера ротора; 9 — светофильтр; 10 — источник света; 11 — термистор; 12 — ротор; 13 — положение балансировочной ячейки: 14 — к насосу; 15 — граница; 16 — раствор; 17, — растворитель; 18 — шл ирен-диаграмма; 19 — индексные отверстия.
Балансиро-
вочная
ячейка
Расстояние от оси вращения
60 Часть II. Методы разделения
||
1з
3
Изображение индексных отверстий балансировочной ячейки
Направление седиментации
Рис. 2.10. Различные стадии седиментации макромолекул.
Седиментограммы получены с помощью шлирен-системы, позволяющей определять коэффициент преломления раствора в любой точке ячейки в разные промежутки времени. По мере движения макромолекул к дну ячейки в ходе седиментации высота пика уменьшается, а ширина его за счет диффузии образца увеличивается.
литической ячейке. Аналитическая ячейка, емкость которой, как правило, равна 1 см3, имеет секториальную форму. При правильной установке в роторе она, несмотря на то что стоит вертикально, работает по тому же принципу, что и ротор с подвесными стаканами, создавая почти идеальные условия седиментации (рис. 2.9). На торцах аналитической ячейки имеются окошки с кварцевыми стеклами. Аналитические ультрацентрифуги снабжены оптическими системами, позволяющими наблюдать за седиментацией частиц в течение всего периода центрифугирования. Через заданные промежутки времени седиментирующий материал можно фотографировать. При фракционировании белков и ДНК за седиментацией наблюдают по поглощению в ультрафиолете, а в тех случаях, когда исследуемые растворы имеют разные коэффициенты преломления — с помощью шлирен-системы или интерференционной системы Рэлея. Два последних метода основаны на том, что при прохождении света через прозрачный раствор, состоящий из зон с различной плотностью, на границе зон происходит преломление света. При седиментации между зонами с тяжелыми и легкими частицами образуется граница, которая действует как преломляющая линза; при этом на фотопластинке, использующейся в качестве детектора, появляется пик. В ходе седиментации происходит перемещение границы, а следовательно, и пика, по скорости передвижения которого можно судить
