Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Концентрация, % Плотность, Г*СМ“а Вязкость, сП
весовые объемные 0°С 2<ГС 0°С 20°С
2,49 2,5 1,010 1,008 1,90 1,06
4,92 5,0 1,020 1,017 2,04 1,13
12,01 12,6 1,050 1,047 2,64 1,43
23,15 25,4 1,100 1,095 4,45 2,24
43,11 51,5 1,200 1,193 19,8 7,94
60,74 78,6 1,300 1,291 275 66,1
68,88 92,5 1,350 1,340 2440 357
тическим давлением. Еще одно преимущество фикола состоит в том, что он не проходит через клеточные мембраны. Для создания градиентов большей плотности применяют соли тяжелых металлов, например рубидия и цезия, однако из-за коррозирующего действия CsCl такие градиенты используются только в роторах, изготовленных из стойких металлов, например титана*
2.3.2. Методика создания ступенчатого градиента плотности
Для создания градиента плотности в центрифужную пробирку осторожно вносят при помощи пипетки несколько растворов с последовательно уменьшающейся плотностью. Затем на самый верхний слой, имеющий наименьшую плотность, наслаивают образец в виде узкой зоны, после чего пробирку центрифугируют. Получить плавные линейные градиенты можно за счет сглаживания ступенчатых градиентов при длительном стоянии раствора. Процесс можно ускорить, осторожно перемешивая содержимое пробирки проволокой или слегка покачивая пробирку.
2.3.3. Методика создания плавного градиента плотности
В большинстве случаев для создания плавного градиента плотности пользуются специальным устройством. Оно состоит из двух цилиндрических сосудов строго определенного одинакового диаметра, сообщающихся друг с другом в нижней части с помощью стеклянной трубки с контрольным клапаном, что позволяет регулировать пропорции, в которых смешивается содержимое обоих сосудов. Один из них (смеситель) снабжен мешалкой и имеет выходное отверстие, через которое раствор стекает в центрифужные пробир-
Гл. 2. Центрифугирование 51
ки. Более плотный раствор помещают в смеситель; второй цилиндр заполняют раствором меньшей плотности. Высота столбика растворов в обоих цилиндрах устанавливается таким образом, чтобы гидростатическое давление в них было одинаковым. Более плотный раствор постепенно выпускается из смесителя в центрифужные пробирки и одновременно замещается равным объемом раствора меньшей плотности, поступающего в смеситель из второго цилиндра через контрольный клапан. Гомогенность раствора в смесителе обеспечивается за счет постоянного перемешивания раствора с помощью мешалки. По мере сливания раствора в центрифужные пробирки плотность его уменьшается и в пробирках создается линейный градиент плотности. Нелинейные градиенты можно создавать при помощи системы, состоящей из двух цилиндров неодинакового диаметра.
Для формирования градиентов плотности различной крутизны пользуются системой из двух механически управляемых шприцов, которые заполняют растворами неодинаковой плотности. Различные градиенты можно создавать, изменяя относительную скорость движения поршней.
2.3.4. Извлечение градиентов из центрифужных пробирок
После завершения центрифугирования и разделения частиц необходимо извлечь образовавшиеся зоны. Это делают несколькими способами, чаще всего методом вытеснения. Центрифужную пробирку прокалывают у основания и в нижнюю ее часть медленно вводят очень плотную среду, например 60—70%-ный раствор сахарозы (весовые %). Находящийся сверху раствор вытесняется, и фракции отбирают при помощи шприца, пипетки или специального приспособления, соединенного через трубочку с коллектором фракций. Если пробирки изготовлены из целлулоида или нитроцеллюлозы, фракции извлекают, надрезав пробирку специальным лезвием. Для этого центрифужную пробирку, закрепленную в штативе, надрезают непосредственно под нужной зоной и отсасывают фракцию шприцом или пипеткой. При подходящей конструкции режущего устройства потеря раствора будет минимальной. Сбор фракций осуществляют также, проколов основание пробирки тонкой полой иглой. Капли, вытекающие из пробирки через иглу, собирают в коллектор фракций для дальнейшего анализа.
2.4. Препаративные центрифуги и их применение
Препаративные центрифуги можно подразделить на три основные группы: центрифуги общего назначения, скоростные центрифуги и препаративные ультрацентрифуги.
52 Часть II. Методы разделения
Центрифуги общего назначения дают максимальную скорость 6000 об-мин-1 и ОЦУ до 6 000g. Они отличаются друг от друга только емкостью и имеют ряд сменных роторов: угловых и с подвесными стаканами. Одной из особенностей этого вида центрифуг является их большая емкость — от 4 до 6 дм3, что позволяет загружать их не только центрифужными пробирками на 10,50 и 100 см3, но и сосудами емкостью до 1,25 дм3. Во всех центрифугах этого типа роторы жестко крепятся на валу привода, и центрифужные пробирки вместе с их содержимым должны быть тщательно уравновешены и различаться по весу не более чем на 0,25 г. Нельзя загружать в ротор нечетное число пробирок, а при неполной загрузке ротора пробирки следует размещать симметрично, одна против другой, обеспечивая таким образом равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.
