Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
отсутствие нуклео-
150 Глава 9
Рис. 9-22. Влияние сборки хроматина на транскрипцию (задача 9-27).
Матрицы для транскрипции предынкубировали в разных условиях: в отсутствие
всех компонентов, необходимых для транскрипции; добавив все, кроме
какого-либо одного компонента (например, - А означает, что отсутствует
TFIIA, и - II означает, что отсутствует РНК-полимераза II); в присутствии
всех компонентов. Определение транскрипции проводили в присутствии всех
или всех за исключением одного компонентов транскрипции.
Очищенная
ДНК
-ДНК в составе хроматина-
Предынкубация
Транскрипция
Транскрипт
О О все -А -В -D -Е -II все
все все все все все все все все
-А
все
-В
все все -D -Е
все
-II
8 9 10 11 12
Рис. 9-23. С
ционной ед (А) и чувст фиолету тр 5S-PHK и i (Б) (задача положение дов
относи (левый ков ционной ел в зависимо ультрафиси дот-гибрид ставленная
зидтрифосфатов (NTP), затем упаковываете матрицу в нуклеосо мы и
выделяете хроматиновую матрицу. Когда вы теперь доба! ляете компоненты,
необходимые для транскрипции (в присутствц NTP), транскрипция идет так
хорошо, как будто вы проводите" с очищенной ДНК (дорожки 1 и 3). Отсюда
вы делаете вывод, чк с матрицей должны связаться один или более
компонентов транс крипции, которые и обеспечивают доступ к промотору.
Для более подробного анализа этого явления вы проводите дв;
дополнительных опыта. В ходе одного из них вы не добавляем отдельные
компоненты, необходимые для транскрипции, в течещ предварительной
инкубации (дорожки 4-8). Во втором опыте н не добавляете отдельные
компоненты, необходимые для транс крипции, в ходе самой транскрипции
(дорожки 9-13).
A. Какой из компонентов, необходимых для транскрипции, должа
присутствовать во время предварительной инкубации, чтобы мат рица
сохраняла свою активность при сборке хроматина?
Б. Какой из компонентов, необходимых для транскрипции, образуй с
матрицей комплекс, оказывающийся устойчивым при сборг хроматина и
последующей очистке?
B. Какой из компонентов, необходимых для транскрипции, следу"
добавить в ходе реакции, чтобы получить транскрипт? j
9-28 Трипаносома-микроорганизм, вызывающий сонную болезнь" может
изменять состав своей гликопротеиновой оболочки и таи"' образом
защищаться от иммунного ответа хозяина. Вы изучай синтез вариабельного
гликопротеина оболочки (VSG-variab! surface glycoprotein) и уже
картировали ген, кодирующий это белок и расположенный вблизи теломеры
одной из хромосо" Однако вам не удалось локализовать промотор. Из ваших
данш следует, что его может отделять от гена VSG много тыст нуклеотидов.
Ваш друг уже давно предлагал использовать для картирован!
промотора облучение ультрафиолетом-метод, который уже xopr-ino
зарекомендовал себя при картировании транскрипционно единицы аденовируса.
РНК-полимераза не может продолжат: транскрипцию через пиримидиновые
димеры, возникающие в р зультате облучения ультрафиолетом, поэтому
чувствительност транскрипции к облучению ультрафиолетом можно использоват
как меру расстояния между началом транскрипции и той точкой в которой вы
определяете транскрипцию. Потерпев неудачу с др| гими методами, вы
решаете испробовать этот подход.
Для калибровки системы вы определяете транскрипцию гена
рибосомной РНК. Транскрипционная единица 5S-pPHK содержа;
Клеточное ядро 151
Рис. 9-23. Строение транскрипционной единицы рибосомной РНК (4) и
чувствительность к ультрафиолету транскрипционных единиц 5S-PHK и других
рибосомных РНК (Б) (задача 9-28). А. Указано расположение
гибридизационных зондов относительно промотора (левый конец стрелки) в
транскрипционной единице. Б. Транскрипция в зависимости от дозы облучения
ультрафиолетом, выявленная при дот-гибридизации (слева) и представленная
в виде графика (справа).
А. ТРАНСКРИПЦИОННАЯ КАРТА 18 S 5,8 S
28 S
хт-с
i_
_!
1 т.п.н.
Б. РЕАКЦИЯ НА ДОЗУ УФ-ОБЛУЧЕНИЯ
О Доза УФ •-------
5S-PHK ффффф pPHKI • ••••
рРНК2 ФФФФФ
рРНКЗ ффффф РРНК4
немногим более 100 нуклеотидов, тогда как гены 18S-, 5,8S-и 28S-pPHK
составляют часть одной транскрипционной единицы длиной 8 т. п. н. (рис.
9-23, А). Вы облучаете трипаносом ультрафиолетом в возрастающих дозах,
выделяете ядра и инкубируете их с 32P-dNTP. Затем выделяете из ядер РНК и
