Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
размером 21 т. п. н. (рис. 9-1, дорожка 1). Однако если мини-хромосома
разрезается рестриктазой BglH, то размеры двух получающихся фрагментов
(13,4 и 3,8 т. п. н.) в сумме меньше 21 т. п. н. (дорожка 2). Если
обработать ДНК другими рестриктазами, то размеры фрагментов в сумме
всегда будут меньше 21 т. п. н. Более того, суммы величин фрагментов,
полученных при обработке разными нуклеазами, различны.
Если неразрезанную мини-хромосому до нанесения на гель
денатурировать и затем ренатурировать, то фрагмент размером 21 т. п. н.
заменяется на двухцепочечный фрагмент, длина которого точно равна
половине исходной молекулы-10,5 т.п.н. (дорожка
3). Сходным образом после обработки BglH, денатурации и рена-турации
фрагмент размером 13,4 т. п. н. заменяется фрагментом вдвое меньшего
размера-6,7 т. п. н. (дорожка 4).
Объясните, почему сумма размеров фрагментов, полученных при
рестрикции, не равна 21 т. п. н. и почему подвижность полос меняется при
денатурации и ренатурации ДНК. Какова может быть, по вашему мнению, общая
организация последовательностей в рибосомной мини-хромосоме?
аботкаВдШ, + - +
етурация
ренатурация - - + +
9-1. Рестрикционный анализ ;сомной мини-хромосомы из ':утепа (задача 9-
3). Числа ib полос указывают размеры хромосомы и фрагментов П.н.
130 Глава 9
Рис. 9-2. Строение искусственной линейной хромосомы, в которой между
теломерами Tetrahymena заключены последовательности дрожжевой и
бактериальной ДНК (задача 9-4). Указаны единичные сайты разрезания тремя
рестрик-тазами.
Г
-PBR322-
Рис. 9-3. Радиоавтограф рестрик-тов плазмидной ДНК (задача 9-4).
Маркерные ДНК, размер фрагментов которых известен, приведены справа (в т.
п. н.).
Hpal Pvull Pvul
9-4 Вы придумали хитроумный способ создания мини-хромосо! у дрожжей. Вам
известно, что при расщеплении рибосомных гено Tetrahymena рестриктазой
BamHI образуется фрагмент размера 1,5 т.п.н., содержащий теломеру. Вы
хотите соединить таи фрагменты с каждым из концов линеаризованной
дрожжевв плазмиды и надеетесь, что после этого плазмида будет существ!
вать как линейная молекула-мини-хромосома.
В качестве плазмидной ДНК вы используете кольцевую пла: миду
дрожжей, содержащую точку начала репликации дрожже (ARS1), маркерный ген
LEU2, по которому можно провести отбо на основе роста дрожжевых клеток, и
последовательности баки риальной плазмиды pBR322 (рис. 9-2). Вы
линеаризуете плазмщ размером 9 т. п. н. с помощью рестриктазы BglH,
которая разрез! ет эту плазмиду только в одном месте. Затем вы инкубируя
линейную плазмиду с фрагментами размером 1,5 т. п. н., несущим теломеру
Tetrahymena, в присутствии ДНК-лигазы и двух рестрш таз-BglII и BamHI.
При анализе продуктов лигирования i обнаруживаете (кроме исходных
компонентов) молекулы разм! ром 10,5 и 12 т.п.н. Вы выделяете фрагмент
размером 12 т.пл и вводите его путем трансформации в дрожжи, после чего
пров! дите отбор на клетки, экспрессирующие маркерный ген в соста"
плазмиды.
Чтобы определить, какая это плазмида, линейная или кольц вая, вы
выделяете из трансформантов общую ДНК, обрабатьш ете препараты
рестриктазами Hpal, Pvull и Pvul, разделяет фрагменты в геле и проводите
их блот-гибридизацию с радиош тивной ДНК pBR322. Схема радиоавтографа
представлена i рис. 9-3.
А. Как по результатам анализа, представленным на рис. 9-3, разл чить
линейную и кольцевую формы плазмиды в трансформ рованных дрожжах?
Б. Объясните, почему лигирование фрагментов ДНК в присутствв рестриктаз
BamHI и BglH обеспечивает получение преимуществе! но мини-хромосомы
нужной конструкции. Последовательной! узнаваемая BglII,-3TO -A*GATCT-,
где знаком * отмечен cai разрезания; последовательность, узнаваемая
BamHI,-эн -G*GATCC-.
9-5 Точная структура теломер полностью не определена ни для одног
организма. Наиболее подробно изучены теломеры, локализова! ные на концах
рибосомных мини-хромосом. Для расшифровки i структуры большое значение
имеют следующие наблюдения.
1. Если рибосомные мини-хромосомы инкубировать с ДНК-пож меразой в
присутствии 32P-dCTP и трех других немечещ dNTP
(дезоксинуклеозидтрифосфатов), то концевые фрагмеш! длиной 3,8 т. п. н.,
полученные при обработке рестриктазо BamHI, метятся гораздо сильнее, чем
центральный фрагмеи содержащий 13,4 т.п.н. (рис. 9-4, дорожка 8). При
инкубащ с одним из dNTP включение наблюдается лишь при использи вании
32P-dCTP (сравните дорожку 1 с дорожками 2-4). Вкл" чение dCTP в
присутствии dATP было значительно бо(r) высоким, чем включение при
инкубации только с dCTP (cj дорожку 5 и дорожку 1). Включение dCTP в
присутствии dCIf
Рис. 9-4. (
мини-хрои
радиоакти
ДНК-П0Л1
Рибосомн]
инкубиро!
ЛИЧНЫХ КС как указа! BamHI. П разделяли фореза и I автографа
Клеточное ядро 131
Рис. 9-4. Строение рибосомной мини-хромосомы (А) и включение радиоактивно
меченных нуклеотидов ДНК-полимеразой (Ь') (задача 9-5). Рибосомные мини-
