Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
следовательно, уровень метилирования гена 5S-PHK не влияет на его
транскрипционную активность.
Б. Результаты транскрипции после обработки матриц рестриктазами такие,
как вы и ожидали. Транскрипция с целиком метилированного макси-гена 5S-
PHK специфически подавляется после обработки рестриктазой Dpnl, которая
расщепляет лишь полностью метилированные сайты рестрикции. Обработка Mbol
специфически подавляет транскрипцию неметилированных генов 5S-PHK, а
обработка рестриктазой Sau3A, которая нечувствительна к уровню
метилирования сайта рестрикции, вызывает подавление транскрипции всех
генов 5S-PHK.
B. Характер транскрипции после репликации и расщепления свидетельствует
о том, что транскрипционные комплексы в ходе репликации не остаются
связанными с макси-геном 5S-PHK. Если бы реплицированные молекулы
оставались в активном транскрипционном комплексе, то транскрипционная
активность должна была бы выявиться после обработки рестриктазой Dpnl,
которая не расщепляет реплицированные молекулы. Активность, остающаяся
после обработки Mbol, определяется полностью метилированными молекулами
ДНК, которые не реплицировались. Если бы транскрипционные комплексы не
удалялись при репликации, то активность сохранялась бы и после обработки
Dpnl.
Г. Если бы всего 50% молекул образовывали активные транскрипционные
комплексы, то распределение полос не должно было бы измениться
(уменьшилась бы только их интенсивность). Однако в этом случае вы не
смогли бы сделать вывода о том, что при репликации происходит удаление
транскрипционных комплексов. Если бы только 50% молекул образовывали
комплексы и только 50% молекул реплицировались, то скептик (каким и
должен быть настоящий ученый) мог бы предположить, что сборка
транскрипционного комплекса подавляет репликацию и реплицируются только
те молекулы, которые не образуют комплексов. Таким образом, в подобном
эксперименте невозможно было бы проверить то, что задумано. Суть
возражений станет понятнее, если вы представите, что 10% молекул
образовали транскрипционные комплексы и 10% реплицировались. Для того,
чтобы ваши выводы оказались правомочными, важно доказать, что молекулы,
несущие транскрипционные комплексы, реплицирова-
Контроль генной экспрессии 419
лись. Хотя можно попытаться каким-либо образом специфически
определить репликацию в транскрипционных комплексах, однако самый простой
способ-это показать, что фракция реплицирующихся молекул значительно
больше, чем фракция молекул, не входящих в транскрипционные комплексы.
Литература: Wolffe, А. P.; Brown, D. D. DNA replication in vitro
erases
a Xenopus 5S RNA gene transcription complex. Cell 47, 217-227,
1986.
-20
A. Сохранение метилированных последовательностей CG зависит от
поддерживающей метилазы, которая обычно присутствует в клетках
млекопитающих. Эта метилаза превращает наполовину метилированную ДНК (в
которой CG метилированы лишь в одной цепи) в полностью метилированную ДНК
(метилированную по комплементарным CG в другой цепи). Такое превращение
должно осуществляться после каждого цикла репликации, чтобы поддерживался
уровень метилирования ДНК. Конструкции, введенные в клетки, напоминали
нормальную, наполовину метилированную ДНК, возникающую при репликации. В
соответствии с этим поддерживающая метилаза превращала наполовину
метилированные сайты CG в полностью метилированные и затем поддерживала
их в метилированном состоянии.
Метилированные цитозиновые нуклеотиды, не входящие в состав
последовательностей CG, не являются субстратом для поддерживающей
метилазы. Следовательно, при каждом цикле репликации их число снижалось
вдвое; таким образом, когда клетки собирали для анализа, концентрация
метилированных цитозиновых нуклеотидов, не входящих в состав
последовательностей CG, была уже так низка, что они не могли быть
обнаружены.
Б. Рестрикционные фрагменты, образующиеся при обработке Hindlll и
чувствительными к метилированию рестриктазами Cfol и Hpall, получаются
именно такими, какие можно было ожидать, исходя из расположения метальных
групп во введенных конструкциях. Поскольку рестрикты размерами менее 1 т.
п. н. не определяли, то фактически в этих экспериментах анализировали
только четыре чувствительных к метилированию сайга рестрикции: оба сайта
Hpall и два сайта Cfol, окружающие центральный сайт Hpall. Если во
введенной конструкции один из этих сайтов не был метилирован, то он
оказывался чувствительным к разрезанию в составе клеточной ДНК. Если во
введенной конструкции один из этих сайтов был метилирован, то он не был
чувствителен к разрезанию в составе клеточной ДНК.
Весьма важно не упускать из вида, что в нормальном гене у-глобина
имеется 27 последовательностей CG. В приведенных экспериментах лишь
четыре из них были проанализированы путем обработки чувствительными к
метилированию рестриктазами. Поскольку большинство последовательностей CG
не являются частью сайтов узнавания для чувствительных к метилированию
