Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
друг другу и, естественно, могут ренатурировать лишь с другими
комплементарными им цепями, восстанавливая при этом свою обычную
двухцепочечную структуру. Наиболее неожиданными выглядят данные о том,
что ри-босомные гены Tetrahymena входят в состав хромосомы микронуклеуса
в виде одной половины инвертированного повтора, образующего мини-
хромосому в макронуклеусе. Следовательно, когда после конъюгации из
микронуклеуса образуется новый макронуклеус, рибосомные гены должны
выщепиться из хромосомы таким образом, чтобы образовался именно
инвертированный димер. Постарайтесь представить себе, как это происходит,
а потом познакомьтесь с точкой зрения авторов одной из работ на эту тему
(Yao, M-С.; Zhu, S-G,; Yao, C-H. Mol. Cell. Biol. 5, 1260, 1985).
Литература: Karrer, К. М.; Gall, J. G. The macronuclear ribosomal
DNA of Tetrahymena pyriformls is a palindrome. J. Mol. Biol. 104,421-453,
1976.
-4
А. Рестрикционный анализ плазмиды показывает, что она представляет собой
линейную молекулу. Если бы молекула была кольцевой, то после обработки
рестриктазами, расщепляющими плазмиду в единственном сайте, должна была
получаться одна полоса, соответствующая длине 12 т. п. н. в каждом
случае, чего на самом деле не наблюдается. С другой стороны, после
разрезания линейной молекулы в одном месте должны получиться две полосы,
дающие в сумме 12 т. п. н. В результате обработки каждой из трех
рестриктаз, разрезающих молекулу в одном участке, получались две полосы,
дающие в сумме 12 т.п.н., следовательно, плазмида должна быть линейной
молекулой.
Б. Расщепление под действием BamHI или BglH приводит к образованию
фрагментов ДНК, содержащих идентичные последовательности (GATC) на 5'-
концах. Следовательно, эти фрагменты могут соединяться во всех возможных
сочетаниях. Гибридные участки, образовавшиеся в результате соединения
ВатШ-конца и BglII-конца (AGATCC и GGATCT), не могут быть разрезаны ни
одним из ферментов. Напротив, участки, образовавшиеся при соединении двух
BamHI-концов или двух BglII-концов, могут быть разрезаны и тем, и другим
ферментом. Следовательно, если присутствуют ДНК-лигаза, BamHI и BglH, то
гомологичные участки, образующие сайт для расщепления BamHI или сайт для
расщепления BglH, снова быстро разрезаются, тогда как гибридные участки,
которые не могут быть разрезаны, накапливаются. Таков способ селективного
получения гибридных соединений.
Литература: Szostak, J. W.; Blackburn, Е. Н. Cloning yeast telomeres
on linear plasmid vectors. Cell 29, 245-255, 1982.
-5
А. Число повторов в концевом фрагменте должно существенно варьировать.
На это указывает широкая полоса, получающаяся при расщеплении
рестриктазой Alul вблизи конца мини-хромо-сомы (наблюдение 6). Если бы
число повторов в каждой молекуле было одинаковым, то полоса, содержащая
концевой фрагмент, оказалась бы узкой и интенсивной, а не широкой.
Отрезок между ведущим и запаздывающим краями этой полосы составляет около
160 п. н., что соответствует примерно 27 повторам. Это и есть масштаб
варьирования числа повторов в теломере.
386 Глава 9
Рис. 9-33. Часть концевого повтора рибосомной мини-хромосомы. Указано
положение специфических пропусков одного нуклеотида (ответ 9-5).
Гораздо труднее определить по этим данным среднее число повторов
на теломеру, так как остается неизвестным расположение сайта узнавания
Alul относительно начала повторов. Однако если расщепление Alul
происходит точно в начале повторов, то число повторов должно в таком
случае варьировать от 60(360/6) до 87(520/6). Полагают, что на одну
теломеру приходится около 70 повторов.
Б. Повторы ССССАА расположены на 5'-концах отдельных цепей мини-
хромосомы. Поскольку синтез ДНК, начинающийся в тан-демно повторенной
последовательности, постепенно распространяется к центру мини-хромосомы
(наблюдение 7), то повторы должны находиться на 5'-концах. Если бы
повторы располагались на З'-концах, то синтез ДНК происходил бы по
направлению к концам мини-хромосомы.
В. Одноцепочечные интервалы в повторах ССССАА по большей части
представляют собой пропуск одного нуклеотида. Поскольку при денатурации
высвобождаются одноцепочечные фрагменты (наблюдение 4), то должны быть
разрывы в фосфодиэфирном скелете. Вероятно, эти разрывы содержат З'-ОН,
поскольку они служат сайтами для синтеза ДНК (наблюдения 1, 3 и 7),
однако они не могут быть простыми разрывами 5'-Р04 с З'-ОН, так как
обработка мини-хромосомы лигазой не приводит к снижению включения
нуклеотидов ДНК-полимеразой (наблюдение 2). Природу этих одноцепочечных
разрывов можно выявить, если произвести замещение свободных 5'-фосфатов
мечеными фосфатами и затем разрушить все связи с пуриновыми нуклеотидами,
что приведет к образованию преимущественно фрагмента ССС (наблюдение 5).
Этот результат указывает на то, что большинство разрывов представляют
собой пропуски одного нуклеотида, а именно первого С(5'-С)-повтора. (Если
