Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
иммунного ответа хозяев. Так, бактерии рода Salmonella (способные
вызывать пищевые отравления) могут существовать в двух формах,
различающихся своими антигенными детерминантами, или фазами, как они были
названы первооткрывателями в 1922 г. Бактерии, находящиеся в двух разньн
фазах, синтезируют разные типы флагеллина - белка, образующего жгутик.
Бактерии, находящиеся в фазе 1, переключаются ш фазу 2 примерно один раз
на тысячу делений клетки. С такой же частотой происходит и обратный
процесс. Изначально были выдвинуты две гипотезы о механизме переключения:
перестройка ДНК, например вставка или инверсия, и модификация ДНК,
например метилирование.
Два типа флагеллинов, ответственных за фазовую вариацищ
кодируются несцепленными генами Н1 и Н2, каждый из которьп кодирует
полностью функциональный флагеллин. Генетически элемент, ответственный за
переключение фаз у бактерий, расположен очень близко к гену Н2. С целью
выявить механизм, ответственный за переключение, был проклонирован
фрагмеш ДНК, содержащий ген Н2. При введении этого гена в Е. coli, ж
имеющую жгутиков, большинство клеток, включивших плазмиду, приобретали
подвижность, т. е. синтезировали флагеллин. кодируемый геном Н2. Однако в
немногих колониях Е. cot клетки были неподвижными несмотря на то, что
несли плазмиду. Если из клонов таких неподвижных клеток выделяли ДНК и
вводили ее в свежие культуры Е. coli, то некоторые из трансформированных
бактерий приобретали подвижность, т.е. в них начинается синтез флагеллина
Н2.
Из культур, в которых произошло переключение, выделял ДНК,
обрабатывали ее рестриктазой, нагревали, чтобы цеш ДНК разделились
(плавление), и затем медленно охлаждал? чтобы цепи ДНК опять соединились
(гибридизация). Затем молекулы ДНК изучали с помощью электронной
микроскопии. Примерно 5% молекул содержали глазок, образованный двум
равными по длине сегментами одноцепочечной ДНК; глазо! находился в одном
и том же месте вблизи одного из концов. Две такие молекулы показаны на
рис. 10-9.
А. Когда клетки Salmonella переключаются с синтеза флагеллина одного
типа на синтез флагеллина другого типа, все клеты сохраняют подвижность.
Почему у Е. coli переключение приводит к замене подвижной формы на
неподвижную?
Б. Объясните, как с помощью этих результатов можно определить, какой
механизм ответственен за переключение: перестройка ДНК или модификация
ДНК?
Рис. 1
ных б
содер:
гапло
ные п
10-17)
ных с
смесь
спеди
ченнь
ных 1
ции г
прот!
из эт
Поел
с рен
выяв
ДНК
Контроль генной экспрессии 173
10-10. Связывание регулятор-белков с фрагментами ДНК, "жащими a-
специфические или оид-специфические регулятор-последовательности (задача
17). Регуляторные белки в раз-сочетаниях инкубировали со ью a-
специфических и гаплоид-фических радиоактивно мете фрагментов ДНК
(показан-на дорожке 1). В конце инкуба-пробы осаждали антителами гав
белков, и фрагменты ДНК тих осадков разделяли в геле, е этого гель
экспонировали тгеновской пленкой, чтобы ить радиоактивные фрагменты
В. Попробуйте с помощью этих результатов определить, с каким типом
перестройки ДНК связано переключение: с делецией, вставкой или инверсией
ДНК?
10-17 Один из ключевых регуляторных белков, синтезируемых локу-сом,
ответственным за тип спаривания у дрожжей, это белок-реп-рессор,
обозначаемый а2 (см. МБК, рис. 10-29). В гаплоидных клетках, относящихся
к a-типу спаривания, белок а2 выключает гены, специфические для типа
спаривания а. В диплоидных клетках типа а/а репрессор а2 действует
совместно с продуктом гена а,, так чтобы в дополнение к a-специфическим
генам выключить набор гаплоид-специфических генов. Двум наборам
контролируемых генов в последовательности ДНК предшествуют, как было
обнаружено, два разных, но родственных между собой типа консервативных
последовательностей ДНК: одна из этих последовательностей расположена
перед а-специфическими генами, а другая-перед генами, специфическими для
гаплоидных клеток. Поскольку эти последовательности сходны, то репрессор
а2 скорее всего связывается с ними обеими, однако его свойства должны
каким-то образом измениться под действием белка до того, как произойдет
узнавание гаплоид-специфической последовательности. Вы хотите понять, за
счет чего происходит это изменение. Катализирует ли а, ковалентную
модификацию а2 или же а, модифицирует а2 за счет стехиометрического
взаимодействия с этим белком?
Для ответа на этот вопрос вы ставите три варианта опыта. Во-
первых, измеряете связывание а, и а2 поодиночке и вместе, с двумя
регуляторными сайтами ДНК, расположенными перед генами. Как показано на
рис. 10-10, сам по себе белок я1 не связывается с фрагментами ДНК,
содержащими один из регуляторных сайтов (дорожка 2), тогда как а2
связывается с а-специфическими фрагментами, но не с гаплоид-
специфическими фрагментами (дорожка 3). В смеси и а2 связываются как с а-
