Молекулярная биология клетки - Уилсон Дж.
ISBN 5-03-001999-5
Скачать (прямая ссылка):
Кроме того, что соответствующие гены разбросаны ш хромосоме тремя
группами, белок агаС, регулятор этого оперена, может осуществлять как
позитивный, так и негативны! контроль. Например, при регуляции группы
генов агаВА\ (рис. 10-5, А) связывание агаС с сайтом 1 в присутствии
арабй нозы (и в отсутствие глюкозы) повышает уровень транскрипци примерно
в 100 раз по сравнению с начальным уровнем, измерен ным в отсутствие
белка агаС. Связывание агаС с сайтом 2 в от сутствие арабинозы подавляет
транскрипцию генов araBAD прв мерно в 10 раз по сравнению с начальным
уровнем, измерении в отсутствие белка агаС. Комбинация эффектов
негативной' контроля в сайте 2 (в отсутствие арабинозы) и позитивноп
контроля в сайте 1 (в присутствии арабинозы) приводит к тыс"
Контроль генной экспрессии 167
некратному повышению уровня транскрипции генов araBAD при
добавлении арабинозы.
Механизм позитивной регуляции путем связывания с сайтом
1 представляется достаточно простым, поскольку этот сайт
расположен по соседству с промотором, так что присоединение белка-
регулятора, вероятно, способствует связыванию РНК-полимеразы или
образованию открытого комплекса. Однако вас больше озадачивают результаты
связывания с сайтом 2. Сайт
2 расположен за 270 нуклеотидов до сайта начала транскрипции.
Регуляторное воздействие на таком расстоянии больше напоминает действие
энхансеров в эукариотических клетках. Чтобы облегчить изучение механизма
репрессии в сайте 2, вы помещаете всю регуляторную область перед геном
galK, кодирующим фермент галактокиназу, активность которой определить
проще, чем активность ферментов, кодируемых генами araBAD.
Для изучения того, какую роль играет расстояние, разделяющее
два сайта связывания белка агаС, вы вставляете или деле-тируете
нуклеотиды в точке встраивания, указанной на рис. 10-5,
А. Активность промотора в отсутствие арабинозы можно затем
определить по росту бактерий на специальных индикаторных агаровых
пластинках, где при полной репрессии промотора образуются колонии белого
цвета, а при синтезе галактокиназы-красного. Вы отмечаете цвет колоний
против шкалы, на которой отложено количество удаленных или вставленных
нуклеотидов (рис. 10-5, Б). К вашему удивлению, белый и красный цвета
чередуются.
Когда вы показываете эти результаты вашей руководительнице, она
остается очень довольна и говорит вам, что эти эксперименты позволяют
определить, какой из трех возможных механизмов репрессии на расстоянии
действует в этом случае: 1) изменение в структуре ДНК распространяется от
сайта репрессии на область транскрипции, и в результате промотор плохо
связывает РНК-полимеразу; 2) белок в сайте репрессии связывается
кооперативно (образуя олигомеры), при этом дополнительные субъединицы
белка продолжают присоединяться до тех пор, пока растущая цепь из
субъединиц не закроет промотор, блокируя транскрипцию; 3) ДНК образует
петлю таким образом, что белок, связавшийся с отдаленным сайтом
репрессии, будет взаимодействовать с белками (или с ДНК) в точке начала
транскрипции.
Какому из этих трех механизмов соответствуют полученные вами
результаты и как вы можете объяснить чередование белых и красных полос?
10-11 Вы разработали систему транскрипции in vitro, используя
определенные сегменты ДНК, транскрибирующиеся под контролем вирусного
промотора. Система начинает работать, когда вы добавляете очищенную РНК-
полимеразу II, TFIID (белок, связывающийся с ТАТА-боксом), TFIIB и TFIIE
(которые связываются с РНК-полимеразой). Однако эффективность
транскрипции в этой системе in vitro низка, поэтому естественно
предположить, что могут существовать и дополнительные регуляторные
последовательности, связывающие те факторы, которых нет среди очищенных
компонентов. Для идентификации последовательностей ДНК, с которыми
связываются эти гипотетические факторы регуляции, вы получаете серию
делеций перед точкой начала транскрипции (рис. 10-6, Б) и сравниваете
активность транскрип-
168 Глава 10
Рис. 10-6. Транскрипция под контролем вирусного промотора (задача 10-11).
А. Неделетированная матрица. Б. Делетированные матрицы. На
неделетированной матрице образуется транскрипт, который на 80 нуклеотидов
длиннее, чем транскрипты с матриц, несущих делеции в расположенных выше
промотора регуляторных областях. При делециях удаляется участок слева от
места, указанного стрелкой. Нуклеотиды пронумерованы от точки начала
транскрипции (+ 1), отрицательными числами обозначены нуклеотиды,
расположенные перед точкой начала транскрипции. В. Результаты
транскрипции смеси делегированных и не-делетированных матриц в грубом
экстракте (слева) и при использовании очищенных компонентов (справа).
Отрицательные числа означают, какую из делегированных матриц включали в
смесь.
А. ЦЕЛАЯ МАТРИЦА
470
Сайт связывания РНК-полимеразы
В. ДЕЛЕТИРОВАННЫЕ МАТРИЦЫ +1
