Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
76. Thoni H., Experientia, 31, 251 (1975).
77. Turkova J., Methods Enzymol., 44, 66-83 (1977).
78. Turkova J., Bldha K., Malanikovd M" Vancurovd D" Svec F" Kalal I.,
Biochim. Biophys. Acta, 524, 162-169 (1978).
79. Turkova J., Bldka K-, Valentovd 0., Coupek J., Seifertova A.,
Biochim. Biophys. Acta, 427, 586-593 (1976).
80. Turkova J., Hubalkovd ОKrtvdkova М., doupek /. Biochim. Biophys.
Acta, 322, 1-9 (1973).
81. Vaquelin G" Lacombe M. L., Hanoune /.. Strosberg A. D., Biochem.
Biophys, Res. Comm., 64, 1076-1082 (1975).
82. Weetall H. H., Sep. Purif. Methods, 2, 199-229 (1973),
83. Weetall H. H., Filbert A. М., Methods Enzymol., 34, 59-72 (1974).
84. Weetall H. H., Mason R. D., Biotechnol. Bioeng., 15, 455-466 (1973).
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
235
<85. Weliky N.. Weetall Н. Н., Gilden R. V., Campbell D. Н.,
Immunochemistry, 1, ' 219-229 (1964).
86. Weston P. D., Avrameas S., Biochem. Biophys. Res. Comm., 45, 1574-
1580
¦87. bkiteley J. М., Jerkunica Deits Т., Biochemistry, 13, 2044-2050
(1974).
88. Wichterle O., Lim D.t Nature (London), 185, 117-118 (I960).
89. Wilchek M" FEBS Lett., 33, 70-72 (1973).
90. Wilchek М., Advan. Exp. Med. Biol., 42, 15-31 (1974).
91. Wilchek M" Miron Т., Methods Enzymol., 34, 72-76 (1974).
92. Wilchek M" Miron Т., Mol. Cell. Biochem., 4, 181-187 (1974).
93. Wilchek М., Oka Т., Topper У. J., Proc. Nat. Acad. Sci, U.S., 72,
1055- 1058 (1975).
94. Wolodko W. Т., Kay С. М., Can. J. Biochem., 53, 175-188 (1975).
95. Yong Af. S., Science, 182, 157-158 (1973).
96. Affinity Chromatography, principis and methods, Parmacia Fine
Chemicals, Uppsala, Sweden.
Глава 9
Характеристика носителей и иммобилизованных аффинных лигандов
Для успешного применения метода аффинной хроматографии необходимо иметь
представления о свойствах как нерастворимых носителей, так и
иммобилизованных аффинных лигандов. Одними из основных свойств,
определяющих возможность использования нерастворимых носителей для целей
аффинной хроматографии, являются сорбционные. В разд. 9.1 приведены
некоторые примеры методик для определения неспецифической сорбции'. Для
связывания аффинного лиганда важно количество активируемых или активных
групп, способных присоединить молекулы аффинного лиганда. В разд. 9.2
описаны методы определения карбоксильных, аминных и гидразидных групп и
цветная реакция с 2,4,6-тринитро-бензолсульфонатом натрия, а также методы
определения оксира-новых групп, ц-нитрофениловых эфиров и винильных и
сульфгид-рильных групп. Число групп, которые могут быть использованы для
иммобилизации, часто оценивается на основе данных о присоединении
низкомолекулярных веществ, например глицина или гли-циллейцина, к
эпоксиактивированным гелям. Некоторые методы определения содержания этих
веществ описаны в разд. 9.3. Из табл. 8,1, в которой приведены количества
глицина и химотрипсина, присоединенных к различным типам сферона, видно,
как важно принимать во внимание размер иммобилизуемых молекул и площадь
поверхности нерастворимого носителя.
Наиболее общие из применяемых методов определения содержания
иммобилизованных аффинных лигандов пеоечислены в разд.
9.3. Среди них, например, спектроскопические, методы, кислотноосновное
титрование, определение аффинных лигандов после их отщепления кислотным,
щелочным или ферментативным гидролизом, элементный анализ, а также
радиометрические методы.
Для иммобилизованных ферментов наряду с определением содержания
связанного белка, общей или относительной активности дополнительную
ценную информацию может дать также титрование активных центров. Примеры
приведены в разд. 9.4. Некоторые методики для наблюдения за
конформационными изменениями даны в разд. 9.5, а методы исследования
распределения белков, связанных на поверхности нерастворимого носителя,-
в разд. 9.6.
Особенно подробное изучение иммобилизованных аффинных лигандов необходимо
главным образом в тех случаях, когда аф-
Характеристика носителей и иммобилизованных лигандов
237
финная хроматография и иммобилизованные ферменты использу-' ются при
решении таких вопросов, как взаимодействие ферментов и ингибиторов и
влияние различного микроокружения на стабильность и каталитические
свойства ферментов.
9.1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВИРУЕМЫХ И АКТИВНЫХ ГРУПП
Неспецифическая сорбция является осложняющим фактором в аффинной
хроматографии. Это уже неоднократно подчеркивалось и детально
рассматривается в разд. 10.3. Например, в агаре - одном из наиболее часто
используемых носителей-как отмечают Порат и др. [55], два типа групп
ответственны за сорбцию, а именно моносульфатные эфирные и' карбонильные
группы.
9.1.1. Определение адсорбционной емкости
0,1%-ный раствор цитохрома с в 0,01 М ацетате аммония при pH 4,1 наносят
на колонку (3X0,5 см) с гелем, уравновешенную тем же буфером до
насыщения; затем колонку промывают, пенса в элюате не перестанет
обнаруживаться белок. Адсорбированный цитохром снимают 0,15 М ацетатом
