Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
поглощает в интервале 240-350 нм. Это поглощение прямо пропорционально
концентрации агарозы и поэтому может быть исключено, если измерение
производят относительно подходящего раствора сравнения. После обработки
0,1 М соляной кислотой (при 75°С в течение 2 ч) агароза имеет
значительный пик поглощения при 280 нм, обусловленный, по-видимому,
фурфуролом, образование которого катализируется кислотой. На-
246
Глава 9
против, 0,1 - 1 М едкий натр в тех же условиях вызывает лишь частичную
карамелизацию геля с широкой областью поглощения в УФ- и видимой частях
спектра; возникающие при этом растворы имеют янтарный цвет. Такие
изменения геля можно предотвратить, если добавить перед нагреванием 0,1%
борогидрида натрия. Тогда спектры будут похожи на спектры водных
растворов.
В разд. 9.2.4 уже упоминалось, что солюбилизация может быть полезна при
количественном определении содержащихся в гелях аминогрупп с помощью
ТНБС.
Степанов и др. [61] солюбилизировали сефарозу с ковалентно связанным
MOHO-N-ДНФ-гексаметилендиамином в 66%-ной три-фторуксусной кислоте при
100°С. Полученный раствор, будучи разбавленным 20%-ной трифторуксусной
кислотой, имел максимум поглощения при 360 нм (УФ-спектре), что могло
быть использовано при определении содержания ДНФ-амина (езбо 15 000),
Бор-хардт и др. [9] гидролизовали модифицированный гель 2 М едким натром
при 100°С перед спектрофотометрическим определением 3,4-диметокси-5-
оксйфенилэтиламина.
Определение степени замещения в ряду агарозных гелей, модифицированных
гидрофобными группами, с использованием 'Н-ЯМР-спектроскопии описано
Розенгреном и др. [57].
Производные агарозы тщательно промывают и высушивают ацетоном на
стеклянном фильтре. 100 г высушенного с отсасыванием .геля перекосят в
Колбу на 50 мл и добавляют 20 мл 85%-ной муравьиной кислоты; смесь
нагревают с обратным холодильником 1 ч на водяной бане. Если за это время
полисахаридный носитель не растворяется, время гидролиза увеличивают.
После гидролиза смесь упаривают досуха, добавляют 2 мл аНгО и вновь
упаривают. Добавление и упаривание повторяют, остаток растворяют в 1 мл
гексадейтеродиметилсуль-фоксида н используют для ЯМР-спектроскопии.
9.3.3. Кислотно-основное титрование
Содержание полярных аффинных лигандов можно определить титрованием
модифицированного геля кислотой или основанием. Хиксон и Нишикава [34]
определили таким образом суммарное содержание л-амннобензамидина,
связанного с помощью водорастворимого карбодиимида с сукцинилированной
гексаметиленди-амин - сефарозой, и остающихся незамещенных карбоксильных
групп.
Производное сефарозы, содержащее карбоксилатные ионы, промывают
50-кратным объемом 0,5 М хлорида натрия, измеряют объем геля после
седиментации или малоскоростного центрифугирования в калиброванном
центрифужном стакане. Гель титруют от pH 7 до pH 3. Всю эту процедуру
повторяют после присоединения n-амииобензамидина; концентрацию
присоединенного аффинного лиганда вычисляют исходя из разности между
объемами, пошедшими иа титрование в двух случаях. Прямым титрованием было
определено содержание М-6-(6-амнногексил)-АМР на сефарозе [13].
Характеристика носителей и иммобилизованных лигандов__________247
9.3.4. Определение иммобилизованных белков, пептидов, аминокислот,
нуклеотидов, углеводов и других веществ после их освобождения с помощью
кислотного, щелочного или ферментативного гидролиза
9.З.4.1. Определение иммобилизованных аминокислот, пептидов и белков
Наиболее часто с этой целью после кислотного гидролиза иммобилизованного
аффинного лиганда используется аминокислотный анализ, разработанный
Спакманом, Стейном и Муром [59]. Наибольшее распространение получила
методика, описанная Аксе-ном и Эрнбеком Г1].
Гели агарозы с присоединенными ферментами освобождают от буфера
промыванием на стеклянном фильтре (№ 3) дистиллированной водой, водно-
аце-тоновон смесью, содержание ацетона в которой постепенно
увеличивается. В заключение коньюгаты промывают ацетоном, который удаляют
в вакууме; препараты сушат в вакууме над пятиокнсью фосфора в течение 48
ч. Проводят кислотный гидролиз (6 М соляная кислота) навески
модифицированного геля при 110°С в течение 24 ч в закрытом эвакуированном
сосуде. Аминокислотный анализ гидролизата проводят на аминокислотном
анализаторе и содержание белка рассчитывают по содержанию аспарагиновой и
глутаминовой кислот. аланина и лейцина. При высоком содержании углеводов
гидролизат темнеет, одиако это не мешает анализу.
Кельш и др. [41] предварительно очищали темный гидролизат, окраска
которого обусловлена кислотным гидролизом полисахаридного носителя на
ионообменной колонке. Гидролизат готовят, используя в качестве
внутреннего стандарта иорлейцин. После удаления HCI иа роторном
испарителе образцы растворяют в 2 мл 0,02 н. соляной кислоты и наносят
либо на колонку {7X1 см) с амберлитом IR 120-Х8 н элюируют 25 мл ! М
раствора аммиака, либо на колонку (7X1 см) с дауэксом 50W-X4 и Элюируют
