Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
264
которых клонов (с низкой степенью резистентности), определенного уровня активности фермента ГФРТ. Об этом свидетельствует также способность таких клонов расти на “контрселективной” среде HAT, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (Littlefield, 1964). Как известно, для роста на такой среде необходимо в большей или меньшей степени сохранение активности ГФРТ. Подобного рода “аномальные” мутанты, растущие и на селективной, и на “контрселективной” средах, были неоднократно описаны в литературе (Shapiro et al., 1985; Gillin et al., 1972; Fenwick et al., 1977). Тем не менее эффективность посева (на среде с 6-ТГ) клеток, характеризующихся даже самой низкой степенью резистентности, превышала эффективность посева клеток исходной популяции на несколько порядков (17 и 0,001% соответственно) (Бобрышева, Варшавер, 1995). Таким образом, среди индуцированных c-Ha-rasl резистентных клонов присутствовали leaky мутанты, которые, как известно, нередко проявляют температурочувствительность (fa) (Fenwick et al., 1977). Среди 6 индуцированных резистентных мутантов, испытанных при рестриктивной температуре 39 °С, 4 оказались температурочувствительными, в то время как среди 20 клонов независимого происхождения, выделенных из родительской популяции, не было обнаружено ни одного fa-мутанта. Анализ fa-мутантов показал, что среди них можно выделить два класса мутантов по температурочувствительности.
Рост мутантов первого типа снижался при повышении температуры только на селективной среде, на неселективной среде различий в росте не наблюдалось. Следовательно, температурочувствительность данных мутантов определялась мутацией в гене hprt. Рост мутантов второго типа зависел только от температуры, и эффективность посева клеток снижалась в одинаковой степени как на среде с HAT, так и на неселективной среде, т.е. температурочувствительность данных мутантов не зависела от уровня активности ГФРТ и, следовательно, определялась мутацией в каком-то другом гене. Таким образом, рост мутантов первого типа зависел не только от температуры, но и от состава среды, в то время как рост мутантов второго класса зависел только от температуры. Эта гипотеза была проверена еще одним методом. Если fa-мутация возникла в гене ГФРТ, то его активность снижается при 39 °С и соответственно возрастают его резистентность и эффективность посева на среде 6-ТГ. Как показывают данные, представленные на рис. 94, такая закономерность наблюдается для клона первого типа 2-V-1, в то время как эффективность посева клеток клона второго типа 2-VII-2 на среде с 6-ТГ не отличается при двух температурах. Это подтверждает предположение о том, что в данном случае fa-мутация возникла не в гене hprt.
На основании приведенных данных можно сделать заключение, что мутагенный эффект онкогена c-Ha-rasl не является локус-специфичным. Аналогичные данные были получены для онкогена c-fos (Van der Berg et al., 1991). Таким образом, возникновение fa-мутаций не только в гене, кодирующем ГФРТ, но и в ряде других генов свидетельствует, что изучение мутагенного действия активированных клеточных онкогенов на уровне одного ло-куса не отражает общей величины индукции мутаций на геном в целом.
Изученные ГФРТ-клоны были исследованы с помощью блот гибридизации на присутствие в их геноме экзогенных ra.s-последонательпостей человека. Анализ радиоавтографов показал возможность применяемой мето-
265
40
35 -
2—V—1 2-VII-2
Рис. 94. Выживаемость (эффективность посева) мутантных клонов на среде, содержащей 6ТГ при 33 и 39 °С
дики обнаружить уникальную последовательность в составе геномной ДНК и не выявил наличия последовательностей плазмиды pEJ6.6 ни у одного из 10 мутантов, индуцированных c-Ha-rasl (Бобрышева, Варшавер, 1995). Эти данные позволяют сделать вывод, что 6-ТГ резистентность индуцированных клонов не связана со стабильной инсерцией плазмиды pEJ6.6, несущей активированный онкоген человека c-Ha-rasl в геномную ДНК, а, следовательно, и с постоянной экспрессией данного онкогена. Так как не обнаружено стабильной интеграции онкогена, то вероятнее всего он оказывает свое мутагенное действие на ранних сроках после введения плазмидной ДНК в клетки, как это было показано для онкогенных ДНК-содержащих вирусов (Shapiro et al., 1984). Очевидно, в данном случае механизм мутагенного действия онкогена можно отнести к типу “hit-and-run”. Этот механизм получил подтверждение в работах по индукции мутаций и злокачественной трансформации, вызываемой некоторыми вирусами (Marengo et al., 1981; Galloway et al., 1983; Bouchard et al., 1988). Результаты проведенных экспериментов позволяют сделать следующие выводы.
1. Показана статистически достоверная индукция генных мутаций и хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка под влиянием плазмид, несущих активированные клеточные онкогены c-Ha-rasl и с-тус.
2. Продемонстрировано, что основной вклад в мутагенную активность плазмиды pEJ6.6 вносит активированный клеточный онкоген c-Ha-rasl.
3. Мутагенный эффект c-Ha-rasl онкогена не является локус-специфич-ным.
