Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Основной принцип картирования с помощью гибридизации соматических клеток основан на двух особенностях клеточных гибридов: 1) возможность отдаленной гибридизации и 2) потеря хромосом одной из родительских форм в ходе культивирования межвидовых гибридов на селективной среде. С этой целью преимущественно используется гибридизация клеток человека и грызунов. Впервые такая элиминация хромосом человека была показана у гибридов между диплоидными клетками человека (ГФРТ+ТК+) и анеуплоидной мышиной линией В 82 (ГФРТ+ТК-) на среде HAT. В ходе культивирования происходила постепенная потеря всех хромосом человека за исключением одной, которая всегда сохранялась у гибрида. Все мышиные хромосомы сохранялись вне зависимости от длительности культивирования. Поскольку на среде НАТ в этом случае способны выживать только клетки с генотипом ГФРТ+ТК+, а ген ТК был привнесен только клетками человека, то, очевидно, ген ТК локализован в той хромосоме, которая всегда сохранялась у гибрида (Weiss, Green, 1967). Помимо среды НАТ для картирования генов при получении гибридов используют также другие селективные среды. Так, на спеде, минимальной по глицину, культивировали гибридные клетки, полученные при слиянии клеток китайского хомячка, ауксотроф-ных по глицину с нормальными диплоидными клетками человека. В ходе
254
культивирования терялись все хромосомы человека за исключением хромосомы, содержащей ген прототрофности по глицину (Као et al., 1969). Это была хромосома 12. Однако в ходе культивирования может сохраняться не одна, а несколько хромосом человека. В таких случаях получают панель гибридов. При их культивировании в селективных условиях в разных гибридах будут элиминироваться разные хромосомы, но всегда остается хромосома, несущая соответствующий нормальный ген, обеспечивающий выживание гибрида в селективной среде. Разработаны также методы, позволяющие ускорить процесс картирования, поскольку элиминация хромосом одного из родительских видов (в данном случае человека), требует достаточно длительного времени. С целью такого ускорения получают так называемые микроклетки, которые исходно содержат неполный набор хромосом. Клетки человека обрабатывают колцемидом, или колхицином, которые нарушают митоз и правильное расхождение хромосом. В результате образуются микроядра с разным числом хромосом, а иногда даже с одной хромосомой. Микроклетки человека сливают с целыми клетками грызуна (Шей, 1985).
Помимо картирования генов в определенной хромосоме, разработаны также методики регионального картирования в определенном участке изучаемой хромосомы. Для этого используют различные методы. Наиболее точный уровень картирования был достигнут при использовании клонированных генов и рекомбинантных ДНК в сочетании с методами генетики соматических клеток. Можно без преувеличения сказать, что применение методов молекулярной биологии революционизировали методы картирования. Применяется гибридизация клонированного гена с метафазными хромосомами гибрида или с хромосомами клеток родительской формы (гибридизация in situ). Важно отметить, что эти методы позволяют картировать гены, не экспрессирующиеся в гибридных клетках, что характерно для многих тканеспецифичных генов. Гибридизация in situ меченых клонированных генов с метафазными хромосомами позволяет с высокой достоверностью идентифицировать участок локализации гена (цит. по: Варша-вер, 2000). Впервые с помощью этого метода были картированы гены а- и (3-глобулинов у гибридов между клетками человека и мыши (Puck, Као, 1982).
ГЕНЕТИКА СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК И ПРОБЛЕМА РАКА
Генетические механизмы превращения нормальной клетки в злокачественную не могли не вызвать самого пристального внимания ученых, работающих в области генетики соматических клеток, поскольку именно соматические клетки организма являются мишенью малигнизации. Уже в самых первых работах при слиянии клеток, характеризующихся разной степенью злокачественности, или злокачественных и нормальных клеток, исследовали проявление признаков трансформированного фенотипа. (Barski, I960’ 1961). Первоначальлые выводы о доминировании признаков злокачественности были вскоре опровергнуты и было установлено, что у гибридов доминирует нормальный фенотип (Harris et al., 1969).
255
Были проведены опыты по переносу признаков трансформированного фенотипа из злокачественных клеток в нормальные с помощью ДНК. В 1971 г. впервые было показано, что ДНК из клеток, трансформированных вирусом саркомы Рауса, индуцировала признаки злокачественности в эмбриональных фибробластах курицы (Hill, Hillova, 1971). Таким образом, было установлено, что признаки злокачественности закодированы в ДНК. Это положение получило дальнейшее подтверждение в конце 70-х и в 80-х гг. Важнейшим из них было открытие клеточных онкогенов, определяющих появление признаков злокачественности. Впервые это было показано на примере переноса в псевдонормальные клетки мыши NIH ЗТЗ ДНК, выделенной из карциномы мочевого пузыря человека. Клетки NIH ЗТЗ характеризуются типичной для малигнизированных клеток способностью к неограниченному росту в культуре, но не обладают другими признаками трансформированного фенотипа, такими, как например, многослойный рост. После трансфекции в культуре появлялись многослойные колонии, и ДНК, выделенная из таких колоний, передавала этот признак при повторных циклах трансфекции. Ген, ответственный за трансформирующий эффект, был идентифицирован и оказался гомологичным вирусному онкогену ras. Его назвали клеточным онкогеном c-Ha-rasl (Shih et al., 1979, 1981). Определение последовательностей показало, что онкоген ras выделенный из различных опухолей (так называемый “активированный” онкоген), отличается от своего нормального аллеля (протоонкогена) точечными мутациями в кодирующей области. Таким образом, появление трансформирующей активности определялось в данном случае, изменением структуры продукта гена ras (Barbacid, 1987; Fasano et al., 1984). В настоящее время показано, что трансформирующая активность онкогена может зависеть не только от изменения структуры его продукта, но и от изменения регуляции его экспрессии, т.е. от количества продукта гена. Наиболее типичным примером такой активации является протоонкоген с-тус, у которого повышение уровня транскрипции связано с хромосомными перестройками, приводящими к переносу гена в участки активно транскрибирующихся генов иммуноглобулинов. Специфические хромосомные аберрации известны в настоящее время для целого ряда опухолей (Погосянц, 1982). Повышение экспрессии может также быть обусловлено амплификацией генов. Примерами могут служить онкоген с-аЫ, а также с-тус (Rabbits Т., Rabbits Р., 1989).
