Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
276
[ф. *
В pcPS!C4lOY
?
Рис. 98. Плазмиды, использованные для трансфекции клеток РС12, были сконструированы на основе вектора pcDNA3 и содержали вставки кДНК различных аллелей hPSl под контролем промотора цитомегаловируса СМУ
А - psPSlwt (hPSl дикого типа); Б - pcPSlM146V; В - pcPSlC410Y. Мутации кДНК обозначены стрелками
плазмиды содержат вставки кДНК различных аллелей гена hPSl под контролем промотора цитомегаловируса человека (CMV): 1) pcPSl wt (hPSl дикого Tima), 2) pcPSlM146V (с мутацией в 6-м экзоне, приводящей к замене Met на Val в 146 положении) и 3) pcPSlC410Y (с мутацией в 12-м экзоне, приводящей к замене Cys на Туг в 410 положении). Структура соответствующих векторов для трансфекции представлена на рис. 98.
Точечные мутации в гене hPSl, приводящие к единичным заменам аминокислот M146V (Alzheimer’s Disease Collaborative Group, 1995) и C410Y (Sherrington et al., 1995), характеризуются аутосомно-доминантным наследованием и приводят к развитию наиболее агрессивной ранней семейной формы БА.
В результате трансфекции и последующей селекции на устойчивость к антибиотику G418 были получены 4 поликлональные культуры, а именно: К-poly (трансфекция вектором pcDNA3), wt-poly (pcPSlwt), M146V-poly (pcPSlM146V) и C410Y-poly (pcPSlC410Y).
Было показано, что данные поликлональные культуры при культивирован™ на различных средах не демонстрируют статистически достоверных различий в скорости роста. Рост клеток определяли по изменению их числа, вычисляемого по показателям оптической плотности при добавлении МТТ
(3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил тетразолиум бромид) - витального реагента, имеющего тропность к митохондриям живых клеток.
Совсем иная картина наблюдалась для индивидуальных клонов независимого происхождения, полученных в тех же вариантах трансфекции, что и поликлональные культуры. На среде, обедненной факторами роста и трофическими факторами ( содержание сыворотки снижено до 1%), и на среде с NGF, вызывающей нейрональную дифференцировку, клетки клонов, трансформированные мутантным hPSl -C410Y, обладали более низкой про-лиферативной активностью. Мы предполагали, что наблюдаемые различия в пролиферации поликлональных и моноклональных культур могут объясняться гетерогенностью клеточной популяции и низким уровнем экспрессии hPSl в поликлональных культурах. По расчетам, сделанным на основе PCR-анализа и Nothem-гибридизации 10-20-ти клонов каждого варианта трансфекции, экспрессия mRNA hPSl отсутствовала у 40% клеток в поликлональных культурах.
Эти предположения подтвердились при анализе экспрессии экзогенного hPSl методом иммуноблота. Для проведения Western-анализа трансфицированных культур в лаборатории были получены поликлональные антитела к N-терминальному участку белка hPSl. Белковый продукт гена hPSl длиной 467 аминокислот локализован как на наружной, так и на внутренних мембранах клетки и имеет в своем составе 8 гидрофобных трансмембранных доменов, гидрофильные С-конец, N-конец и петлю, ориентированные в одну сторону - в цитоплазму. Известно, что полноразмерный белок hPSl 43-45 kD в норме подвергается эндопротеолизу в районе гидрофильной петли и присутствует в клетке в виде двух основных фракций: N-концевого фрагмента 27-28 kD и С -концевого фрагмента 16-17 kD (Рогаев, 1999).
Western-анализ показал, что в трансфицированных различными формами гена hPSl культурах, в отличие от контрольной (К-poly), наблюдается сильный сигнал в районе 43-45 kD, соответствующий непроцессированному белку экзогенного PS1 человека. Кроме того, во всех культурах присутствует 30 kD форма эндогенного пресенилина крысы (степень гомологии пресе-нилинов крысы и человека около 96%).
Нейронально дифференцированные под действием NGF (100 ng/ml, в течение 6 дней) клетки трансфицированных культур на ранних пассажах были подвергнуты воздействию апоптотических стимулов, таких как депривация (культивирование в течение 24 ч на среде без сыворотки и NGF) и окислительный стресс (культивирование в течение того же времени на бессыворо-точной среде с добавлением 100 цМ перекиси водорода). В качестве контроля использовали клетки, культивируемые на бессывороточной среде с добавлением NGF. Апоптотическими считали клетки, ядра которых при окрашивании флуоресцентным красителем имели выраженную степень конденсации или фрагментации (рис. 99).
Количество клеток в контрольных вариантах практически не отличалось во всех культурах и на гистограмме (рис. 100) приведено к 100%.
Видно, что во всех исследованных культурах в контрольных условиях степень апоптоза была незначительной. Депривация же вызывала существенную гибель клеток. Этот эффект был еще более выражен при окислительном стрессе. Наиболее выраженная гибель клеток в обоих случаях наблюдалась в культуре C410Y-poly, в которой за 24 ч исчезало более 70%
278
в о
<3 <
*
Q ° СО • О
о Э ^ * . *
Рис. 99. Конденсация и фрагментация ядер клеток РС12 под действием апоптотических стимулов
А - контрольные клетки (стандартная среда + NGF); Б - культивирование клеток в течение 24 ч на среде без сыворотки и NFG: В - культивирование в течение 24 ч на бессывороточной среде с добавлением 100 цМ перекиси водорода (+ NGF + Н202); 1 - фазовый контраст; 2 - окрашивание ядер по Хехсту. х400
