Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
С этой же генетической конструкцией нами были получены также несколько линий трансгенных свиней. Однако явных признаков ускоренных темпов роста животных замечено не было, за исключением случая увеличения в 1,5 раза размеров почек и печени у двух трансгенных мертворожденных потомков, где была доказана экспрессия трансгена (Андреева и др., 1990).
Гормон эритропоэтин (ЭПО) является важным фактором дифференцировки эритроидных клеток. Трансгенные животные могут быть удобной моделью для исследования биологического эффекта ЭПО в организме, механизма действия этого гормона и регуляции экспрессии соответствующего гена. Нами были получены трансгенные мыши, содержащие ген ЭПО человека под контролем LTR RSV (Мудрик и др., 1991). Как показали проведенные исследования, длительное действие трансгена не оказывало эффекта на гематокрит и содержание гемоглобина в эритроцитах и ретикулоцитах периферической крови (рис. 67). Вместе с тем при исследовании костного мозга трансгенных мышей были выявлены значительные изменения в составе эритрона. В среднем количество клеток эритроидного ряда увеличивалось более чем в 3 раза по сравнению с таковыми у контрольных животных, причем наибольшее статистически достоверное увеличение происходило в количестве нормобластов и ретикулоцитов, т.е. неделящихся клеток. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что костный мозг является достаточно закрытой системой. Существенное увеличение концентрации ЭПО, происходившее за счет экспрессии трансгена, которое приводило к сильному изменению важных параметров этой системы, не отражалось на состоянии периферической крови трансгенных животных.
197
Большинство трансгенных животных, созданных к настоящему времени, получено путем прямой микроинъекции генов в пронуклеусы зигот, но эффективность переноса генов остается довольно низкой (менее 1 %). Поэтому одной из основных задач в области трансгенной технологии животных является создание такой системы направленного изменения генома, которая бы значительно снизила затраты на их получение. В последние 10 лет в этой области наметился заметный прогресс. Появилось целое поколение генов-ре-портеров, с помощью которых, с одной стороны, можно заранее отобрать трансгенных эмбрионов перед тем как переносить их суррогатной матери для их дальнейшего развития, а с другой стороны, наблюдать локализацию экспрессии генов на разных этапах онтогенеза, в различных тканях и органах, минуя стадию определения наличия трансгена.
К таким репортерным генам относятся гены lacZ Е. coli, секреторной щелочной плацентарной фосфатазы (SFAP), люциферазы светлячка, зеленого флуоресцентного протеина и др. Дополнительно к этим методам для отбора трансгенных эмбрионов ранних стадий развития используют полимеразную цепную реакцию и флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) (Chan, 1999). Так, в наших работах ген lacZЕ. coli под контролем или LTR вируса саркомы Рауса (RSV-/«cZ) или промотора CMV (CMV-lacZ) был использован для исследования динамики экспрессии трансгенов в ходе эмбрионального развития вьюнов и мышей. Было показано, что экспрессия трансгена с RSV-промотором, которую наблюдали у 3-5-суточных личинок вьюна, не зависела от стадии развития икринки, на которой вводился экзоген (ранний бластодиск, поздний бластодиск, 2-бластомерный зародыш) и области введения генетического материала (цитоплазма бластодиска или желток яйцеклетки). Вместе с тем при инъекции гена в желток наблюдали меньшее количество точек экспрессии, а их распределение в 75% случаев ограничивалось поверхностью желточного мешка. Наличие экзогенной ДНК в одной из серий опытов доказано у 100% 5-6-недельных личинок, инъецированных в цитоплазму бластодиска, и 67% личинок, инъецированных в желток (Андреева и др., 1993; Андреева, Дворянчиков, 1995). Сравнение уровней экспрессии RSV-lacZ и CMV-lacZ генов в трансгенных эмбрионах и личинках вьюна показало, что впервые она выявляется на поверхности бластодермы 10-11-часовых зародышей, инъецированных геном CMV-lacZ, и 13-14-часо-вых зародышей, инъецированных геном RSV-/acZ. Максимальные уровни экспрессии RSV-lacZ гена наблюдали у l-5-суточных эмбрионов, а гена CMV-lacZ - с первых суток эмбрионального развития (рис. 68) и до 2-месяч-ного возраста (рис. 69). На любой из исследованных стадий эффективность экспрессии трансгена была значительно большей у особей, инъецированных CMV-lacZ-геном по сравнению с геном RS V-lacZ. Она не зависела от того, вводился ли трансген на стадии зиготы или 2-клеточного зародыша, несколько снижалась у особей, инъецированных на стадии 8 клеток и морул, и только единичные особи, инъецированные на стадии бластулы, экспрессировали трансген. По мере развития эмбрионов с геном CMV-lacZ спектр экспрессирующих тканей сужался, и у 6-8-недельных личинок экспрессию наблюдали только в мышцах плавников и туловищной мускулатуре. В отдельных сериях экспериментов экспрессию и наличие трансгена наблюдали у 100% особей, что было подтверждено PCR-анализом и блот-гибридизацией по Саузерну (Андреева и др., 1996).
198
