Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
186
Сбор оплодотворенных яйцеклеток
Инъекция ДНК в один из
Потомство (около 10% содержит трансген)
Тестирование наличия трансгена
Скрещивание трансгенных мышей и получение гомози! отных трансгенных животных
Рис. 59. Классическая схема трансгеноза
Рис. 62. Трансгеииая мышь с геном гормона роста быка (слепа) н контрольная мышь (справа)
кого искусственного конструкта привел к ускоренному росту мышей в онтогенезе и значительному увеличению веса трансформированных животных, развившихся из прооперированных зигот. Аналогичные результаты были получены и в нашей работе, когда в качестве чужеродной ДНК использовали клонированный нами ГГР быка, находящийся под контролем LTR вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV) (Генинг и др., 1987). Вес трансгенных самцов был примерно на 50% больше, чем у контрольных мышей, и эти фенотипические особенности передавались потомству (Газарян и др., 1988) (рис. 62).
Вскоре анализу стадио- и тканеспецифической экспрессии были подвергнуты сотни структурных генов, генов различных вирусов, онкогенов, антионкогенов и др. (Palmiter, Brinster, 1986; Тарантул, Мудрик, 1991).
К середине 80-х годов были начаты эксперименты по созданию трансгенных сельскохозяйственных (с/х) животных. К этому времени были подобраны оптимальные условия для визуализации пронуклеусов зигот с/х животных, поскольку большинство зигот имеет значительное количество пигментных и жировых гранул, затрудняющих процесс микроинъекции (Wall et al., 1985) (рис. 63) (Андреева и др., 1990).
В первой из опубликованных работ по получению трансгенных кроликов, свиней и овец авторы использовали в качестве трансгена ГГР человека, однако столь драматического ускорения темпов роста животных, как это было получено на мышах, не наблюдалось (Hammer et al., 1985). Вместе с тем у трансгенных свиней были замечены увеличение эффективности потребления пищи и заметное снижение жира. Следует подчеркнуть также, что у трансгенных свиней с повышенным содержанием в крови гормона роста человека отмечались отклонения в состоянии здоровья.
188
В это же время совместно с коллегами из Восточной Германии (Дум-мерсдорф, Росток) нами были проведены эксперименты по микроинъекции ГГР быка под контролем промотора MMTV в зиготы крупного рогатого скота с использованием промежуточных реципиентов. Эти эксперименты явились одной из первых попыток работы по изменению генотипа крупных с/х животных. В результате у одного из родившихся животных было доказано наличие чужеродной ДНК. Однако трансген был перестроен и содержал в своем составе только LTR MMTV и последовательности плазмидного вектора (Roschlau et al., 1989а, b).
Попытки переноса ГГР быка, овец, человека, гена рилизинг-фактора гормона роста человека (выход гормона роста в кровь находился под контролем эндогенных регуляторов) в дальнейшем были продолжены на зиготах овец (Ward et al., 1990), свиней (Андреева и др., 1990), кроликов (Газарян и др., 1988) и рыбах (Chen, Power, 1990) как в нашей стране, так и за рубежом.
Трансгеноз открыл новые пути направленного изменения продуктивности разных видов с/х животных (повышение темпов роста, изменение количества и качества молока, шерсти, увеличение плодовитости), получения животных-биореакторов ценных биологически активных препаратов (таких как фактор свертываемости крови, а-антитрипсин, гемоглобин и антитела в молоке, крови или моче), создание новых форм и пород животных, приспособленных к биомедицинским исследованиям, которые могут быть источниками органов для ксенотрансплангации, пород, устойчивых к различным заболеваниям (Wall et al., 1997; Chan, 1999; Muller, Brem, 1998; Cozzi et al., 2000). В частности, с успехом для направленной экспрессии фармакологических белков используются гены, кодирующие основные белки молока - казенны. В России, например, были получены трансгенные мыши, экспрессирующие в молоко ценный медицинский препарат - у-интерферон человека (600 мкг у-интерферона на 1 мл молока) (Lagutin et al., 1999).
В одном из наших экспериментов гены хлорамфениколацетилтрансфе-разы Е. coli и гормона роста быка были подставлены под контроль 5'-области гена х-казеина. Однако анализ экспрессии трансгена у полученных нами трансгенных мышей показал, что выбранная последовательность 5'-области гена х-казеина не обеспечивала активной экспрессии в эпителиальных клетках молочной железы (Попов и др., 1995).
Одним из генов, имеющих фармакологическую ценность, является ген, кодирующий гранулоцит-колоний-стимулирующий фактор (Г-КСФ) человека. В настоящее время с нашим участием ведутся исследования по анализу экспрессии гена Г-КСФ, находящегося под контролем промотора и 3'-фланкирующей области гена (Х^-казеина быка (Дворянчиков и др., 2000) в молоке полученных нами трансгенных мышей (работа проводится совместно с исследователями государственного университета г. Рио-де-Жанейро, Бразилия). Методом иммуноферментного анализа у трансгенных самок в лактирующей молочной железе обнаружен рекомбинантный белок на уровне 0,1-0,3 мкг в мл. Были проведены тесты на биологическую активность белка в молоке трансгенных мышей с помощью Г-КСФ-зависимой миелоид-ной линии клеток мышей, первичной культуры костного мозга мышей и человека в агаре. Оба теста выявили стимулирующую активность молока в разведении, соответствующей концентрации 1-2 пкг/мл рекомбинантного белка (Dvoryanchikov et al., 2003). Предполагается, что данная генетическая
