Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1 - Свердлов Е.Д.
ISBN 5-02-002753-7
Скачать (прямая ссылка):
Важнейшим моментом в технологии направленного изменения генов явилось создание ткане- и стадиоспецифического индуцибельного генного таргетинга с использованием cre-loxP и других подобных систем. Сге (cyclyzation recombination) является белком фага Р1 с молекулярным весом 38 КД, обладающим рекомбиназной активностью. Эта циклирующая реком-биназа катализирует процесс рекомбинации между сайтами loxP (locus of X-over of PI), которые могут быть расположены в любой ориентации друг к другу. Один из методов получения направленных хромосомных перестроек in vivo, основан на комбинации двух технологий: 1) получение ЭСК, в которые с помощью гомологичной рекомбинации введены /tuP-сайты в желаемые локусы внутри одной хромосомы или в разные негомологичные хромосомы. Такие ЭСК используют для получения химерных животных, а затем и их потомков, несущих эти /ахР-сайты; 2) получение трансгенных мышей, в геном которых введена генетическая конструкция, содержащая Сге под контролем конститутивного или тканеспецифического промотора. С помощью скрещивания получают двойных трансгенных мышей, у которых происходит рекомбинация между этими /ахР-сайтами, благодаря активности ре-комбиназы Сге. Таким образом удается получать животных с направленными хромосомными перестройками. Этот подход во многих случаях способствовал преодолению такого отрицательного момента, как появление у нокаутированных мышей леталей на ранних стадиях развития, и позволил изу-
208
Получение
бластоцисты
Выделение клеток внутренней клеточной массы
Культивирование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)
Перенос
бластоцисты
приемной
матери
Инъекция таргетированных ЭСК в хозяйский эмбрион
Таргетинг
гена
Химера
Потомство, произошедшее из клеток хозяйского эмбриона
произошедшее из таргетированных ЭСК
Рис. 76. Схема получения трансгенных мышей путем направленного изменения (таргетинга) генов в ЭСК
чать функции генов в отдельных типах клеток и тканей на разных стадиях развития организмов (Muller, 1999; Серов, Матвеева, 2001).
В результате внедрения в практику этих технологий в настоящее время получены принципиально новые данные о функции более тысячи различных генов (DeChiara, 2001).
209
Таким образом, генный нокаут, как и перенос новых генов, митохондрий и целых хромосом, позволяет не только определять функцию гена, но и моделировать некоторые патологии человека. В настоящий момент этот прием становится одним из ключевых в молекулярной генетике. Его чрезвычайная важность на данном этапе исследований определяется массовым переходом от исследований по структурной генетике к функциональной генетике.
ТРАНСГЕНОЗ И КЛОНИРОВАНИЕ ЖИВОТНЫХ
Новая страница в области модификации геномов животных была открыта после сенсационных успехов по клонированию животных (Wilmut et al.,
1997). Сама техника клонирования основана на переносе ядер соматических клеток донора в цитоплазму энуклеированного ооцита реципиента (рис. 77). В данном случае речь идет уже о генетических манипуляциях на уровне целого генома. В настоящее время после пересадки ядер соматических 'слеток (фибробластов, фолликулярных клеток, клеток Сертоли, клеток гранулезы и др.) в энуклеированные ооциты получены клонированные овцы (Wilmut et al., 1997), коровы (Kubota et al., 2000), мышк (Wakayama et al., 1998), козы (Baguisi et al., 1999), свиньи (Polejaeva et al., 2000), кошки (Shin et al., 2002). Вне всякого сомнения, эта техника в комбинации с методами трансгеноза открывает самые широкие возможности для генетической модификации геномов животных. К настоящему времени нокаутированию подвергнуто огромное количество генов мышей, исследованы функции нескольких тысяч генов. Развитие техники клонирования значительно сокращает путь получения животных с целенаправленными изменениями функций генов. Однако стабильные линии ЭСК (см. выше) получены только у некоторых линий мышей.
Альтернативным подходом к решению этой проблемы явились исследования по трансформации чужеродными генами клеток фибробластов плодов с последующей пересадкой их ядер в энуклеированные ооциты овец и коров (Schnieke et al.,1997; Cibelli et al., 1998), что привело к рождению трансгенных потомков. А в 2000 г. появилось первое сообщение (McCreath et al., 2000) о целенаправленном введении в клеточную культуру фибробластов плода овцы вектора, созданного на основе al (1)-проколлагенового гена овцы, содержащего в своем составе ген a 1-антитрипсина человека под промотором Р-лактоглобулина. Были отобраны клоны фибробластов, прошедшие гомологичную рекомбинацию и экспрессирующие a 1-антитрипсин человека. Ядра этих фибробластов пересадили в энуклеированные ооциты овец, а эмбрионы, развившиеся из них до стадии морулы или бластоцисты, были перенесены суррогатным матерям для их дальнейшего развития. Из 16 проанализированных плодов и новорожденных 15 содержали в своем геноме таргетированную аллель. 14 потомков развилось до рождения, и трое из них достигли годовалого возраста. У одной из самок был обнаружен в молоке a 1-антитрипсин в количестве 650 мкг/мл.
Аналогичным путем были получены трансгенные свиньи, в которых был нокаутирован один аллель локуса a-1,3-галактозилтрансферазы, ответственной за острую реакцию отторжения органов при ксенотрансплан-
