Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Чтобы создать адсорбент, следует прежде всего подумать о лигандах и возможных способах взаимодействия их с белком. Желательно, чтобы присоединение лиганда к носителю происходило в точке, не совпадающей с областью взаимодействия белка с лигандом; здесь могут быть полезны некоторые сведения об аналогах субстрата и величинах их Ки Если можно выбирать между двумя лигандами, различающимися по размеру, следует выбрать более крупный, так как в этом случае существует больше различных способов присоединения его к носителю. Вероятность удачного присоединения небольшой молекулы, подобной аланину, незначительна, поскольку фермент, узнающий аланин, почти наверняка использует обе его заряженные группы и узнает метальную группу, отличающую его от других аминокислот. Таким образом, при использовании методов присоединения1 аланина, показанных на рис. 4.43, имеется мало шансов на то, что они не нарушают способности фермента узнавать эту молекулу. С другой стороны, адениновые нуклеотиды были успешно присоединены к агарозе в нескольких положениях (рис. 4.44).
Исходным материалом может служить обычная или предварительно активированная агароза (активация бромцианом,, эпоксиактивация, а также введение карбонилдиимидазольных и тозильных групп) либо агароза, содержащая гексильную боковую цепь, оканчивающуюся карбоксильной группой или аминогруппой. Реакции с избытком лиганда или его аналога могут проходить в органических или водных растворителях — в зави-
1Рис. 4.43. Возможные способы иммобилизации аланина в качестве лиганда .для аффинного адсорбента.
симости от химизма процесса. После завершения реакции определяют количество иммобилизованного лиганда.
Опыты по определению эффективности адсорбента обычно проводят в пастеровских пипетках; небольшой образец фермента, растворенный в подходящем буфере (не более 1 мл), наносят на адсорбент и колонку промывают. Если в этих условиях фермент остается на колонке, можно предположить, что а больше
0,9 и адсорбция идет быстро, поскольку скорость потока в пипетке, наполненной адсорбентом, выше оптимальной. Затем проводят опыты по элюции. Очень важен буфер, используемый вначале; как указывалось выше, устранение ионообменных эффектов может быть нежелательным (если только не слишком высоки биоспецифические взаимодействия), и можно попытаться работать при различной ионной силе, с разными буферами и солями. Существуют три основных метода элюции. Аффинная элюция буфером, содержащим лиганд, представляет собой идеальный, но в некоторых случаях слишком дорогостоящий метод. Часто используют весьма высокие концентрации лиганда, потому что между белком и адсорбентом в данном буфере возникает настолько сильное взаимодействие (а>0,999), что приходится повышать величину I (см. уравнение (4.9)). Если сначала изменить буфер так, чтобы величина а снизилась приблизительно до 0,9, то можно использовать более низкие концентрации лиганда, как это описано для аффинной элюции с ионообменников.
Для того чтобы снизить а перед проведением аффинной элюции, необходимо иметь представление о характере взаимодействий между белком и адсорбентом. Повышение концентрации соли значительно снижает биоспецифическое связывание белка,
Разделение белков путем адсорбции
161
он он
Г\1б-ацил-АМР
С8-ацил-АМР
,NH ОН
Ацил-АМР, связанный через рибозу
Рис. 4.44. Три способа присоединения АМР для получения аффинного адсорбента.
но может также привести к ослаблению взаимодействия белка со свободным лигандом при аффинной элюции (повышение величины /Cl). Повышение концентрации соли ослабляет любые неспецифические ионные взаимодействия, но при этом усиливаются гидрофобные взаимодействия белка с адсорбентом, в особенности с удлиняющим мостиком. Если взаимодействия последнего типа важны, более эффективным может быть снижение концентрации соли. Кроме того, используют вещества, снижающие поверхностное натяжение (уменьшающие гидрофобные вандерваальсовы взаимодействия). Это может быть неионный
11—1078
162
Глава 4
детергент, такой, как тритон Х-100 в концентрации до 1% (по объему), этиленгликоль (10—50% по объему) или относительно небольшое количество этанола (до 5% по объему). При использовании заряженного лиганда этанол в указанной концентрации, скорее всего, не влияет на величину Kl. После предварительной промывки колонки этим буфером проводят аффинную элюцию с помощью лиганда, растворенного в том же буфере.
Второй метод заключается в применении высокой концентрации соли, вызывающей нарушение всех негидрофобных взаимодействий *между иммобилизованным лигандом и белком, в том числе любых биоспецифических ионных или других полярных сил. Повышение концентрации соли приводит к возрастанию гидрофобных сил, и один из недостатков данного способа состоит в том, что ,при его использовании могут усилиться неспецифические взаимодействия. Тем не менее соль обычно вытесняет белок. Иногда происходит слишком сильное связывание и ни соль, ни свободный лиганд не способны вытеснить белок (это в особенности относится к иммуноадсорбентам, см. разд. 4.7). В таких случаях могут быть полезны хаотропные соли, например тиоцианат при высоких концентрациях. Иногда для этого лучше использовать низкие значения pH (но не слишком низкие, чтобы не денатурировать белок).
