Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
272
Глава 7
ным нагревом и охлаждением. Если раствор необходимо охладить до О °С перед добавлением к нему органического растворителя, то следует помнить, что охлаждение нескольких литров раствора займет очень много времени. Используйте стеклянные контейнеры, так как пластики очень плохо проводят тепло. С другой стороны, если достигнута низкая температура, она легче сохраняется при больших объемах раствора.
Целесообразность проведения процедуры в более крупном масштабе фактически является вопросом здравого смысла; такая операция всегда связана с большими затратами времени и потому требует тщательного планирования. Уменьшение масштабов очистки позволяет провести ту или иную процедуру быстрее, и это нужно учитывать. Если центрифугирование продолжается только 5 мин, а пропускание через колонку — в пределах одного часа, ясно, что работа в небольшом масштабе может быть завершена за очень короткое время. Поэтому, если нужно получить лишь небольшое количество конечного продукта, следует рассмотреть возможность уменьшения масштабов операций. Ниже описывается очистка фруктозо-:1,6-бисфосфат-альдолазы из экстракта мышц кролика (экстракт можно хранить продолжительное время при —30 °С).
Расчет затраченного на все операции времени начинают вести с того момента (нулевое время), когда берут 50 мл оттаявшего экстракта; pH доводят до 6,0; все операции выполняют при 25 °С.
Растворяют в экстракте 112 г сернокислого аммония (затраченное на это время составляет 2 мин); перемешивают смесь 5 мин; центрифугируют при 20 ООО g в течение 3 мин.
Растворяют в надосадочной жидкости 6 г сернокислого аммония, перемешивают суспензию и центрифугируют, как указано выше; растворяют осадок в 5 мл буфера.
Обессоливают раствор в буфере К-МОПС, pH 7,0, на колонке с сефадексом G-25 объемом 50 см3 (10 мин).
Пропускают полученный раствор через колонку с КМ-целлюлозой (4 см2Х4 см), промывают колонку К-ТЭС буфером, pH 7,5 (10 мин).
Добавляют в этот буфер 0,2 мМ фруктозо-1,6-бисфосфат, в результате чего альдолаза элюируется; добавляют 0,5 г сернокислого аммония на 1 мл фермента (3 мин); перемешивают суспензию 5 мин и центрифугируют; ресуспенди-руют осадок для кристаллизации.
Оптимизация методов и соблюдение рекомендаций
273
Затраченное время (мин):
О Растворение сернокислого аммония, перемешивание, центрифугирование.
20 Растворение сернокислого аммония, перемешивание, центрифугирование.
40 Растворение осадка, обессоливание.
60 Пропускание раствора через КМ-целлюлозу, промывка колонки буфером с pH 7,5.
80 Элюирование фермента буфером, содержащим фруктозо-1, 6-Рг; высаливание сернокислым аммонием.
100 Центрифугирование; ресуспендирование осадка для получения кристаллов.
Четыре процесса — фракционирование сернокислым аммонием, обессоливание, ионный обмен с аффинной элюцией и концентрирование раствора с помощью высаливания — занимают
2 ч работы. Это исключительно простой пример, но и многие другие процедуры очистки могут быть очень быстро выполнены при проведении их в небольшом масштабе. Едва ли стоит проводить все эти процедуры на холоде, особенно если это несколько замедлит весь ход работы (см. разд. 7.1).
Иногда бывает необходимо уменьшить масштабы опубликованной методики, если авторы работали с очень большим количеством исходного материала. Например, «110 кг мышечной ткани лошади было...» (!) [164]. В таких случаях следует принимать во внимание соображения, обратные тем, о которых шла речь, когда обсуждались вопросы, связанные с увеличением масштаба операций. Обычно при попытке воспроизвести опубликованную методику сначала проводят опыты с небольшим количеством материала, поэтому возникает двойная проблема — уменьшения масштаба операций и воспроизведения опубликованных результатов. Этот вопрос обсуждается в следующем разделе.
7.3. ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ ОПУБЛИКОВАННОЙ МЕТОДИКИ
Этот раздел касается большинства исследователей; существует так много опубликованных методик (иногда.десятки для одного и того же фермента), что неразумно начинать работу, не ознакомившись с предшествующей литературой. Многие пытаются в точности следовать всем указаниям, данным в опубликованной методике. Часто это приводит к успеху, и в этом случае нет необходимости вносить какие-либо изменения, кроме самых мелких. Но столь же часто опубликованная методика оказывается совершенно невоспроизводимой и не приводит к
274
Глава 7
получению сколько-нибудь пригодного препарата фермента. Иногда это вина авторов, а иногда — результат небрежности тех, кто пытается повторить уже разработанную процедуру. Цель данного раздела состоит в том, чтобы описать подходы, которые следует использовать как в начале работы, так и позднее, если что-то не получается.
Прежде всего необходимо отличать несущественную информацию от важных фактов. Следующие примеры взяты из опубликованных методик:
«Осадок экстрагировали 469 мл буфера А... и подвергали диализу в течение ночи против буфера А для удаления этанола».
