Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Фракционирование органическими растворителями—>непосредственно за ним следуют:
Ионный обмен
Аффинная адсорбция и т. д.
Фракционирование неорганическими солями (на холоде) Гель-фильтрация
Обессоливание на колонке, как указано выше, I
или упаривание при пониженном давлении------------------ --------- ——'
Изоэлектрическое (при низких концентрациях солей) осаждение—*- непосредственно за ним следует любой другой метод
Ионный обмен, аффинная адсорбция и т. д.—непосредственно за этими процедурами следуют:
Фракционирование солями
Фракционирование органическими растворителями Другие аффинные или адсорбционные методы
I
Концентрирование ^раствора с помощью ультрафильтрации или высаливание--------1
Гель-фильтрация
Гель-фильтрация—^непосредственно за ней следует любая другая методика
268
Глава 7
обмен, но если фермент адсорбируется слабо, то эндогенные соли, осажденные органическим растворителем вместе с белками, могут слишком сильно повысить ионную силу и помешать адсорбции. В табл. 7.3 дан краткий перечень основных последовательных стадий фракционирования и указаны промежуточные операции, которые выполняются между основными стадиями и позволяют перейти от одного этапа к другому. Необходимо отметить, что во многих случаях, особенно перед стадией хроматографии, требуется центрифугирование для осветления раствора.
Некоторые возможные последовательности этапов фракционирования без промежуточных операций показаны ниже.
Соль —> Гель-фильтрация —> Ионный обмен
Органический растворитель —*¦ Аффинная адсорбция, модифицированный красителем адсорбент и т. д.
Органический растворитель —> [Ионный обмен! —> Соль —>
| Аффинная ад-|
I сорбция J
—> Гель-фильтрация : Аффинная адсорбция-----> Соль —> Гель-фильтрация
Следует помнить о емкости каждого метода; методы осаждения особенно подходят для первого этапа, так как они позволяют работать с очень большим количеством материала. Гель-фильтрация характеризуется умеренной емкостью, если нет возможности использовать колонки огромных размеров. Аффинной адсорбции свойственна низкая емкость, однако этот метод позволяет обработать (большое количество белка, если фактически адсорбируется лишь незначительная его доля. «Обессоли-вание», которое можно провести очень быстро, применяется в следующих удобных для практического использования схемах:
Солевое фракционирование —> «Обессоливание» —*¦
Ионный обмен или аффинная адсорбция —*-
Концентрация с помощью «высаливания» —»- Гель-фильтрация
‘или
Органический растворитель —> Солевое фракционирование —> 1«Обессоливание»----> Ионный обмен или аффинная адсорбция
1 При условии что этих трех или четырех этапов достаточно, ^часто всю процедуру можно завершить за 5—6 ч и если неочищенный экстракт получен в начале рабочего дня, то очистка
^достигается за II день. Но. допустимы и паузы, при условии что
1 ' ;
Оптимизация методов и соблюдение рекомендаций
269
деградационные изменения предотвращены, насколько это возможно. Рекомендуются два основных метода хранения белка в течение ночи или даже несколько более длительного времени.
11. Хранение осадка, полученного путем осаждения белкового раствора сернокислым аммонием, на холоде (без замораживания), причем лучше не разводить его буфером. Высокая концентрация соли стабилизирует фермент и обычно ингибирует протеазы. Однако таким способом нельзя хранить неочищенные фракции неограниченно долгое время: самый длительный срок хранения при этом составляет не более 2—3 дней при 4 °С.
2. Хранение белков в замороженном виде. Если температура достаточно низка, все деградационные процессы прекращаются, и образец можно хранить в течение неопределенно долгого времени. Рекомендуется поддерживать температуру ниже —50 °С. Обычные температуры глубокого замораживания (но не выше —15°С), как правило, подходят для хранения белковых растворов в течение одной ночи. Однако не следует замораживать разбавленный раствор белков; весьма вероятно, что в разбавленных растворах (<2 мг-мл"1) белки будут денатурировать при замораживании и последующем их оттаивании (кроме того, такие растворы занимают больше места в морозильнике). Перед замораживанием необходимо измерить pH и убедиться, что раствор хорошо забуферен. Замораживать растворы следует в пластиковых контейнерах (стеклянные контейнеры трескаются, когда при образовании льда объем раствора увеличивается). Оттаивание замороженных растворов нужно производить быстро, погружая контейнеры в теплую воду. При проведении крупномасштабных работ для этой цели можно применять, соблюдая осторожность, микроволновую печь. Необходимо помнить, что пластики являются плохими проводниками тепла, и даже если снаружи температура воды составляет 50 °С, внутренняя поверхность контейнера будет иметь температуру не выше 30 °С; если же раствор во время оттаивания перемешивать, мало вероятно, что произойдет тепловая денатурация.
