Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
В заключение следует отметить, что временной фактор может быть очень важен при работе с лабильными ферментами или экстрактами, обладающими высокой протеолитической активностью. В конечном счете, может быть, лучше проводить как можно скорее одну стадию за другой, жертвуя при этом в какой-то мере качеством разделения, чем доводить каждый процесс до совершенства, но тратить больше времени на выделение. С другой стороны, при очистке стабильных ферментов, может быть, лучше уделять больше внимания максимальной степени разрешения, особенно если это устраняет необходимость в последующих этапах очистки для удаления примесей.
270
Глава 7
7.2. УВЕЛИЧЕНИЕ И УМЕНЬШЕНИЕ МАСШТАБОВ ОПЕРАЦИЙ
Пробные опыты выполняют обычно с небольшим количеством материала, с тем чтобы увеличить их масштабы, когда методика будет разработана. Исследователи, занимающиеся очисткой ферментов, часто испытывают чувство разочарования из-за того, что при увеличении масштабов работы что-то не ла* дится и результаты не получаются такими, как ожидалось. Это особенно досадно, когда на получение сырья затрачено много усилий, а в итоге приходится отказываться от всей методики фракционирования. Полезно обсудить, какие параметры могут изменяться при проведении очистки белков в больших масштабах и что следует делать в таких случаях по крайней мере теоретически, чтобы свести к минимуму эти изменения.
Первым источником изменчивости является экстракт. Очевидно, что для обработки большего количества сырья требуется другой, более крупный гомогенизатор. Продолжительность процедуры, необходимой для разрушения всего материала, так же, как и состав экстракта, может изменяться. Даже если количество экстрагированного фермента будет сопоставимо с его количеством в пробных опытах, вполне вероятно, что содержание других белков и небелкового материала в экстракте будет совсем иным, а это может повлиять на условия фракционирования. Кроме того, различные количества загрязняющих белков, проходящих через второй, третий и последующие этапы фракционирования, могут полностью изменить первоначальные результаты. Если проблема заключается именно в этом, то рекомендуется провести пробные опыты с экстрактом, полученным в большом количестве.
Проведение стадий осаждения в более крупном масштабе не должно вызывать каких-либо затруднений. Но следует отметить, что осадок после центрифугирования содержит какую-то долю надосадочной жидкости и эта доля зависит от плотности осадка. В пробных опытах часто используют центрифугирование на довольно высоких скоростях (так как при этом можно получить большие величины g с помощью маленьких роторов), тогда как при проведении опытов в более крупных масштабах это часто становится невозможным. В результате осадок оказывается менее плотным, и поэтому большая часть примесей переходит на следующую стадию. Еще важнее количество оса-дителя, попадающего на следующую стадию; например, избыточное количество сернокислого аммония может полностью нарушить весь процесс гель-фильтрации; белки могут даже вновь выпасть в осадок в самой колонке. Если трудности связаны с недостаточной плотностью осадка, то решить эту проблему можно, переместив суспензию после декантирования большей
Оптимизация методов и соблюдение рекомендаций
271
части надосадочной жидкости в небольшую центрифугу, чтобы провести скоростное центрифугирование.
Прежде чем приступить к проведению колоночной хроматографии в более крупном масштабе, необходимо все хорошо обдумать. Важное значение здесь имеют количество белка, приходящегося на единицу объема адсорбента, и скорость потока. Теоретически при увеличении количества нанесенного белка в 10 раз площадь поперечного сечения колонки (без изменения ее высоты) следует увеличить тоже в 10 раз и в 10 раз повысить скорость потока. Однако, как уже говорилось выше, для коротких и толстых колонок характерна неравномерность потока, так что лучше пойти на компромисс, увеличив оба размера колонки — и поперечное сечение, и высоту. Объем колонки следует повышать пропорционально количеству наносимого на нее белка; наилучшим компромиссным решением будет сохранение прежних пропорций между шириной и высотой колонки. Таким образом, если в пробном опыте использовалась колонка высотой 5 см и диаметром 1 см, то для увеличения объема хроматографического слоя в 10 раз нужно взять колонку высотой 12 см и диаметром 2 см (исходя из того, что в продаже нет колонок любого возможного диаметра). Скорость потока, выраженная в см-ч-1, должна быть такой же, как и в опыте с колонкой небольшого размера. Так как площадь поперечного сечения в четыре раза больше, скорость потока, выраженная в мл-ч-1, должна быть только в четыре раза выше. Следовательно, время пропускания раствора через колонку будет в 2,5 раза больше. При идеальном потоке буфера поведение белка и разрешение должны зависеть только от соотношения между объемом колонки и количеством нанесенного на нее образца. При фиксированной скорости потока (см-ч-1) форма колонки не имеет значения.
Основные различия между пробным опытом и более крупномасштабной процедурой выявляются тогда, когда необходимо изменить температуру. Легко нагреть 100 мл до 50 °С за две минуты, сохранить эту температуру в течение 5 мин, а затем быстро охладить раствор. Но значительно труднее нагреть 2000 мл раствора, так как из-за недостаточно быстрого теплопе-реноса неизбежны и более медленное достижение нужной температуры, и более медленное охлаждение раствора'. Таким образом, если имеется стадия тепловой денатурации, то следует убедиться, что в критический период непосредственно до и после достижения максимальной температуры денатурация идет не в большей степени, чем это необходимо. Быстрый нагрев можно осуществить с помощью микроволновой печи. Однако и в этом случае остается проблема быстрого охлаждения. Поэтому нужно провести опыт в небольшом масштабе с медлен-
