Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Метод кокультивации. Этот метод может рассматриваться как индукция опухолей в искусственных условиях. Сначала получают культуру протопластов, затем на начальной стадии ее роста, когда протопласты только что регенерировали клеточную стенку и начали делиться, культуру заражают агробактериями. Период кокультивации, в течение которого протопласты агрегируют с бактериями, составляет 32 ч.
Модификация метода кокультивации протопластов с А. tumefaciensе позволила повысить его эффективность (до 10'1) и сократить время получения трансформантов до трех недель. При этом в качестве селективного признака использовали то обстоятельство, что только трансформированные клетки способны расти без добавок фитогормонов.
Микроинъекции Д Н К ¦ В ряде экспериментов было показано, что метод микроинъекций может успешно применяться для трансформации растительных клеток аналогично микроинъекциям животных клеток (см. с. 189). Это стало возможным после преодоления ряда технических трудностей, в частности, разработки метода получения протопластов для инъекций путем прикрепления их к стеклам полилизином.
Для микроинъекций применяется микроигла с внешним диаметром 2 мкм и внутренним 1 —1,25 мкм. Объем инъекций в каждый протопласт составляет (1 —10)* I0 4 мл, при концентрации ДНК—0,1—1,0 мкг/мкл.
Трансформация растительных клеток происходит с эффективностью 10—20%, независимо от типа вектора. В этом смысле метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Важно также, что трансформация не является видоспецифичной, и ее можно применять, когда другие способы переноса генов невозможны (например, агробактерии имеют ограниченный круг хозяев). Многие исследователи полагают, что м.икроинъек-ции пригодны для всех типов растений.
Эл ектропорация. Этот метод основан на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. Для растительных протопластов процедура электропорации оказалась очень эффективной. Метод состоит в следующем: на растительные протопласты в высоких концентрациях, находящиеся в среде электропорации, содержащей ДНК, действуют высоковольтным импульсом. В результате молекулы ДНК поглощаются клетками через поры в клеточной мембране. Далее после разведения протопласты высеваются на соответствующую среду для проращивания. Эффективность переноса определяется через 24—48 ч после электрошока (напряжение 200—350 В, длительность импульса 54 мс).
При переносе электропорацией удалось получить экспрессию чужеродных генов. Она показана на двух типах промоторов— NOS (нопалинсинтетазного) промотора Ti-плазмиды А. tumefaciens, под контролем которого экспрессировалась хло-рамфениколацетилтрансфереза (CAT), и 355-поромотора вируса CaMV.
Упаковка в липосомы. Это один из методов, используемых для защиты экзогенного генетического материала, который вводится в протопласты растений, от разрушающего действия нуклеаз.
Экзогенный генетический материал, вводимый в протопласты растений, нуждается в надежной защите от действия ферментов— нуклеаз, которые разрушают нуклеиновые кислоты. Один из методических подходов заключается в использовании липосом. Липосомы — это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. Их можно получить в результате резкого встряхивания или обработки ультразвуком водных эмульсий фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фос-фатидилсерина и холестерина, наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений.
С помощью липосом в протопласты растений были введены РНК вируса табачной мозаики, ДНК Ti-плазмиды А. tumefaciens, а также целые метафазные хромосомы. Особенно важно для системы переноса в протопласты растений то, что липосомы надежно защищают молекулы нуклеиновых кислот от действия нуклеза, присутствующих в значительных количествах вне клеток. К преимуществам систем переноса с помощью липосом можно отнести их низкую токсичность по отношению к клеткам и возможность их использования на множестве растений, клетки которых способны утилизировать липосомы.
В заключение следует подчеркнуть, что дальнейшее совершенствование методов прямого переноса генов в существенной 202
степени зависит от роста эффективности трансформации клеток. К настоящему времени эффективность прямого переноса генов в протопласты повысилась в 100 раз по сравнению со временем первых сообщений. Без селекции 2% всех колоний подвергаются трансформации.
Метод биологической баллистики. Метод биологической баллистики (биолистики) является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации однодольных. В качестве исходного материала для трансформации берется суспензионная культура, каллусная ткань или 4—5-днев-ные культивируемые незрелые зародыши однодольных.
Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички вольфрама, диаметром 0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Вольфрамовые частички, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток наносится в чашку Петри с агаризированной средой и помещается под биолистическую пушку на расстоянии 10—15 см. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с огромной скоростью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления вольфрамовых частиц, в то время как в зоне 0,6—1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.
