Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
G С G Т 1 1 1 1 |
Меченая/ затравка
-I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—I—г-
TTAGACCCGAT AAGCCCGCA
Нч А Т Т >— и'
+
С
__L-
G G G
-I_I—I—
">
и/
С
I
G G G С
А Т
G G
_|____I__
">
С
_1_
G G G
_|____I____I_
Т
_I—
G
_|_
С С С
J___1_L
G _1_
ddATP ddTTP ddCPT ddGTP
a)
Рис. 3.3. Схема эксперимента по секвенированию ДНК (по Сэнгеру) (а) и р диоавтограмма, полученная в результате эксперимента (б)
где находилось разрушенное основание. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках; затем проводят радиоавтографию, и фрагменты, содержащие радиоактивную метку, оставляют отпечатки на рентгеновской пленке. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание— его положение. Так набор полос на рентгеновской пленке определяет нуклеотидную последовательность
ДНК.
С помощью этого метода за короткий срок удалось установить полную нуклеотидную последовательность
ДНК SW 40, а также последовательность рекомбинантной плазмиды pBR 322, о которой речь пойдет ниже.
Другой метод, разработанный Сэн-гером и названный его именем, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Ферменты, синтезирующие ДНК, называют ДНК-полимеразами. Они катализируют образование ДНК только в присутствии предсуще-ствующих ДНК-матриц, и нуклеотидная последовательность новосинтезированных цепей ДНК комплементарна последовательности матриц.
Сэнгер использовал ДНК-полимеразу I. В клетке этот фермент участвует в процессе репликации, заполняя пробелы между вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки). Для работы фермента в пробирке требуются предшественники ДНК — дезоксирибонуклеотидтрифосфаты
(дНТФ), а также одноцепочечная матрица, на которой должен быть небольшой двуцепочечный участок — затравка, с которого начинается синтез.
Были синтезированы модифицированные предшественники — Дидезоксирибонуклеотиды для каждого из четырех оснований ДНК. ДНК-полимераза включает эти предшественники в ДНК.
Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезокси-рибонуклеотидом. В результате рост (элонгация) данной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид (ддНТФ). Поэтому их называют терминаторами элонгации.
Реакционная смесь по Сэнгеру состоит из цепи ДНК, нуклеотидную последовательность которой надо определить, короткого фрагмента меченой ДНК, комплементарной концевому отрезку этой цепи (затравка), одного из четырех ддНТФ и соответствующего дНТФ в строго определенном соотношении (чтобы они конкурировали), а также остальных трех дНТФ. Готовят четыре смеси, каждая из которых содержит один из четырех ддНТФ. В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов, длина которых соответствует местоположению одного из четырех оснований. Меченые фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле (с точностью до одного нуклеотида), проводят радиоавтографию и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК (см. рис. 3.3).
В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины — вполне разрешимая задача. Уже определена последовательность нескольких сотен генов про- и эукариот. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Раньше для определения структуры белка приходилось делать тщательный и весьма трудоемкий анализ выделенного и очищенного белка. Сейчас часто бывает проще определить структуру белка через нуклеотидную последовательность, чем с помощью прямого секвени-рования. Если секвенирование белка занимает месяцы и даже годы, то ДНК удается секвенировать за несколько недель. Определение последовательности ДНК привело также к тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и репликации ДНК.
Сразу вслед за разработкой быстрых методов секвенирова-ния появились столь же быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной последовательностью. Теперь за три-четыре дня можно синтезировать последовательность из 12—20 нуклеотидов. Автоматизация этой процедуры еще более облегчает и ускоряет синтез. Появились приборы — ДНК-синтезаторы, которые выполняют эту работу за несколько часов.
3.2. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК
Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Ключевыми в этом определении являются слова «фрагмент ДНК» и «объединение in vitro», что собственно и указывает на сущность генетической инженерии и на ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких, как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т. д.
