Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
Что уж говорить о переносе генов. Не решив двух первых задач, нельзя было ни выделить гена, ни расшифровать его структуру и структуру последовательностей нуклеотидов, которые к нему примыкают и обеспечивают его экспрессию. Одна из причин такой ситуации заключается в том, что даже простейшие организмы содержат очень длинные молекулы ДНК (геном кишечной палочки составляет несколько миллионов нуклеотидных пар), а геном млекопитающих и человека содержит около трех миллиардов пар оснований, и это далеко не предел. В геноме содержится несколько десятков тысяч генов. Наибольшего интереса заслуживает изучение конкретных генов — задача, которая представлялась совершенно недоступной для решения.
Трудно, да, пожалуй, и невозможно было предвидеть, что в течение нескольких последующих лет стремительное развитие -химических и энзимологических методов приведет к созданию рекомбинантных ДНК и положит начало новой науке — генетической инженерии, составной части современной биотехнологии.
Рестриктазы и их классификация. В основе метода, позволившего непосредственно приступить к манипуляциям с генами, лежит открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Еще в 1953 г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма Е. coli, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма С), не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на мелкие фрагменты. В 1966 г. было показано, что это явление связано со специфической модификацией хозяйской ДНК — она содержит несколько метиллированных оснований, отсутствующих в немодифицированной ДНК, причем метилирование (добавление к основанию метильной группы— СН) происходит уже после завершения репликации. Таким образом, клетка-хозяин как бы «метит» свою ДНК по определенной последовательности, а чужую ДНК расщепляет, «узнав», что эти же последовательности не мечены.
В 1969 г. были открыты специфический модифицирующий фермент, метилирующий ДНК, и рестриктаза, которая расщепляла неметилированную ДНК. Однако этот фермент не был высокоспецифичен по отношению к определенной последовательности ДНК. Вскоре была выделена первая рестриктаза, которая расщепляла строго определенную последовательность
ДНК.
Поскольку бактерии по-разному метят свою ДНК, то и рестриктазы должны узнавать разные последовательности. И, действительно, с тех пор выделены рестриктазы, узнающие более 150 сайтов рестрикции (мест расщепления ДНК).
Рестриктазы бывают мелко- и крупнощепящими. Первые узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем вторые, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов. Например, в ДНК бактериофага 17, состоящей из 40000 пар оснований, отсутствует последовательность, узнаваемая ре-стриктазой R1 из Е. coli.
Поетроение рестрикционных карт. Рестриктазы по-разному расщепляют ДНК. Одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности, а другие — со сдвигом с образованием «ступеньки». В первом случае образуются так называемые «тупые» концы, а во втором — «липкие», т. е. фрагменты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в четыре нуклеотида. Такие фрагменты удобны для создания рекомбинантных ДНК (табл. 3.1).
Сайты узнавания рестриктазами симметричны относительно поворота на 180°, т. е. последовательность нуклеотидов слева направо в одной нити такая же, как справа налево в другой.
Таблица 3.1. Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности
Микроорганизм
Сокращение
Последовательность
5'->3’
3’->5’
Bacillus amytoliguefaciens Н Brevibacterium albidum Escherichia со Li RY13 Haemophilus aegyptius Haemophilus aegyptius Haemophilus haemolyiicus Haemophilius influenzae Rd Haemophilus influenzae Rd Haemophilus parainfluenzae Haemophilus parainfluenzae Providencia stuartu 164 Streptomyces albus G Xanthomonas aryzae
Bam HI Bal I Eco RI Hae II Hae III Hha I Hind II Hind III Hpa I Нра II Pst I Sal I Xor II
G GATCC CCT+AG^G TGGCCA ACC/rGGT G ATTC CTTAA-fG PuGCGC Py Py^CGCGPu GG CC CC^GG GCG С C^GCG GTPy PuAC CAPu^PyTG A AGC TT TTCGA^A CTT AAC CAA^TTG С CGG GGC^C CTGCA G GrACG TC G TCG AC CAGCTG CGATC^G G^CTAGC
Ферменты рестрикции стали эффективным инструментом исследования. Они позволяют превращать молекулы ДНК очень большого размера в набор фрагментов длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч оснований. С помощью метода электрофореза в агарозном геле фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно легко разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно. Метод электрофореза основан на разделении молекул ДНК, движущихся с различной скоростью в электрическом поле. В растворе ДНК существует в виде аниона и при помещении раствора в конденсатор молекулы будут двигаться к положительной обкладке. Чем длиннее молекула, тем больше ее заряд и сила, но больше и сопротив-158
