Сельскохозяйственная биотехнология - Шевелуха Е.А.
Скачать (прямая ссылка):
ление среды. Одиако сопротивление среды увеличивается с ростом длины иначе, чем сила. В результате молекулы данной длины будут двигаться с постоянной скоростью, которая будет зависеть or длины молекулы.
Если вышеупомянутую процедуру проделать в растворе, то разделения достигнуть не удастся. Поэтому гель-электрофорез осуществляют в носителе, которым служит гель-концентрирован-ный раствор полимера. Отсюда и название метода. Гель образует трехмерную полимерную сеть, ячейки которой заполнены растворителем. Эта сеть придает конструкции жесткость и составляет по массе лишь несколько процентов геля. Таким образом, использование геля в качестве среды, где проводится электрофорез, позволило решить проблему разделения фрагментов ДНК-
Короткие фрагменты мигрируют намного быстрее, чем длинные. При сравнительно высокой концентрации агарозы большие фрагменты вообще не могут проникнуть в гель. В процессе миграции рестрикционные фрагменты не деградируют, их можно элюировать (вымывать) в виде биологически активных двуцепочечных молекул. При окрашивании гелей красителями, связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых отвечает рестрикционному фрагменту, молекулярную массу которого можно определить, проведя калибровку с помощью ДНК с известными молекулярными массами (рис. 3.1).
Использование электрофореза для разделения рестрикционных фрагментов дает возможность получать рестрикционные карты. Первая карта была получена для вируса SW 40 (обезьяний вирус, вызывающий злокачественную трансформацию), содержащего 5423 пары оснований (рис. 3.2). Использовали ре-стриктазу Hindll, расщепляющую кольцевую ДНК вируса на
11 фрагментов. Порядок их расположения в ДНК был установлен путем исследования наборов фрагментов, образующихся по мере того, как расщепление доходит до конца. Первый разрыв превращал кольцевую молекулу в линейную, которая затем расщеплялась на все меньшие фрагменты. Исследовали вначале наборы перекрывающихся фрагментов, а затем продукты полного расщепления. Таким образом была получена рестрикционная карта кольцевой вирусной ДНК, на которую были нанесены сайты расщепления рестриктазой. Повторив подобные эксперименты с другой рестриктазой, можно получить более подробную карту, где отмечено много сайтов рестрикции.
Располагая такой информацией, можно идентифицировать на ДНК биологически важные участки. Так, например, показано, что репликация вируса SW 40 всегда начинается в одном специфическом Hindll фрагменте и продолжается в обоих направлениях. Для этого кратковременно метили реплицирую-
Рис. 3.1. Разделение фрагментов ДНК, обра* зовавшихся под действием рестриктаз с помощью электрофореза;
а —ДНК фага Я/HiadlM, ДНК фага <рХ 174/На^ П1, ДНК плазмиды pBR322/BslN I (и знаменателе дроби — на знание рестрикта зы), б — схематическое изображение фра1ментон ДНК фа1а X под действие ем различных рестриктаз (на шкале указаны размеры фраf мептоп)
о)
Oral Ог»Ш Еае I E#ji Eco47lll fco0109 fcofll fcoRV Esp\
6)
щуюся ДНК радиоактивными элементами, расщепляли образовавшиеся фрагменты Hindll и сравнивали их с картой.
Затем рестрикционные карты и рестрикционные фрагменты были использованы для картирования участков ДНК, на которых синтезируются мРНК для вирусных белков.
Определение нуклеотидной последовательности. Методы, позволившие идентифицировать генетически важные участки ДНК, имели большое значение. Но они также способствовали разработке исключительно эффективных новых методов секве-нирования ДНК и создания рекомбинантных молекул. Секвени-160
BamH I 2533 Ban II 2258
Рис. 3.2. Генетическая и рестрикционная карта ДНК вируса SW 40 (ori-сайт инициации репликации; цифрами указано положение сайтов рестрикции)
рование позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность сегмента длиной 100—500 нуклеотидных пар, образующегося при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами.
Один из методов основан на химической деградации ДНК. Он был предложен в 1977 г. Максамом и Гилбертом и назван их именем (рис. 3.3). Суть метода сводится к следующему: один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изотопа фосфора Р; препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех оснований. Условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений. При обработке поврежденных молекул пиперидином в ДНК образуется разрыв в том месте,
ООО
III 0 Основание 0=Р-Р-Р-0ч/у/ Терминирующие полимеризацию | | | \_/ дидезоксинуклеотиды
ООО Н Н Не может образовать фосфодиэфирную
L-1— связь со следующим dNTP
5' цепь ДНК
~1—I—I—I—I—I—I—I—I—г-
TTAGACCCGA
-|—I—I—I—|—I—г-
А A G С С С G
С А
ДНК-полимераза
+4dNTP
+4dATP
