Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
185
Рис. 1.57. Микрофотографии нитевидных структур
Контрастирование 0,1%-ным водным раствором уранилацегата. Стрелки указывают на одиночные молекулы FjFQ-АТРазы. Калибровка — 0,1 мкм
мому, это затрудняло встраивание белковых молекул в липидный матрйкс.
Таким образом, для успешной реконструкции FiFo-АТРазы в липидный бислой необходимо наличие в диализуемой смеси молекул фосфа-тидилхолина с различной длиной и степенью насыщения углеводородных цепей (как в случае СФХ или ЯФХ), что обеспечивает более точное соответствие липидного окружения внутримембранной части белкового комплекса. При этом встраивание молекул АТРазы в липидный бислой менее избирательно по отношению к типу используемых для реконструкции детергента и липида, чем упорядоченность белковых молекул этого комплекса в липидном матриксе.
Для получения плоских мембранных фрагментов с плотно упакованными в них молекулами белка наиболее подходящими в качестве детергента оказались системы ЯФХ или ЛДАО. Однако для получения двухмерных кристаллов необходимо оптимизировать и ряд других параметров реконструкционного эксперимента: pH, ионную силу, добавку двухвалентных катионов и др. Данные по влиянию pH на образование мембранных структур F]F0-ATPa3bi в этой реконструкционной системе приведены в табл. 1.16. Образование протеолипосом и мембранных фрагментов происходит практически по всему диапазону pH от
3,3 до 8,5, однако размеры таких структур могут сильно варьировать. В двух диапазонах pH: 3,3-3,7 и 5,0-6,4 происходит образование больших моноламеллярных протеолипосом (до 1 мкм в диаметре) (рис. 1.55). При pH около 7 протеолипосомы невелики по размерам (0,1-
0,3 мкм). Большие мембранные фрагменты (линейные размеры 0,5— 1,0 мкм) присутствовали в препаратах с pH 4,3-8,5 (рис. 1.56). При значениях pH < 4,3 происходит образование небольших мембранных фрагментов (линейные размеры < 0,3 мкм). Таким образом, варьируя pH, можно подобрать условия для получения протеолипосом и мембран определенного размера.
Образование нитевидных структур в препаратах F,F(rАТРазы происходит в узком диапазоне pH (около 4,8). Нити могут быть замкнуты в кольцо и иметь продольные размеры до 1 мкм, поперечные в пределах
186
Таблица 1.16
Влияние pH среды на образование мембранных структур FjFo-АТРазы
Характерные белково-липидные структуры, образующиеся в результате диализа
pH среды Протеолипосо- Мембранные Двухмерные Нити
мы, диаметр, фрагменты кристаллы
мкм
Линейные размеры, мкм
3,0-3,2 0,2-0,3 * - -
3,3-3,7 0,3-0,5 * - -
3,8-4,2 * До 0,3 - -
4,3-4,6 * До 1 До 0,4 -
4,7-4,9 * 0,5-1 До 0,4 До 1
5,0-5,5 До 1 0,5-1 - -
5,6-6,4 0,3-0,6 0,5-1 - -
6,5-7,2 До 0,3 0,5-1 - -
7,3-8,5 * До 0,5 - -
Примечание. Описанные выше структуры были получены при следующих условиях: СФХ/ЛДАО/Р|Рд-АТРазы (1:1:1 по массе); концентрация FiFg-АТРазы 3 мг/мл; состав буфера для диализа: 50 мМ СНзСООЫа (при pH 3,0-6,4) или 50 мМ Трис-HCl (при pH 6,5-8,5), 5 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 5 мМ NatoPC^; продолжительность диализа 24 ч; t = 20°.
* Структурные образования содержатся в образцах в незначительных количествах.
0,015-0,02 мкм. Типичные электронные микрофотографии таких структур приведены на рис. 1.57. Эти структуры, по-видимому, представляют собой расположенные в два ряда молекулы F]F0-ATPa3bi, присоединенные друг к другу своими гидрофобными областями. Основную роль в таких взаимодействиях должен играть мембранный сектор F0, а вне-мембранные части комплекса, вероятно, экспонированы на поверхности нити. Возможно, что нитевидные образования в силу их относительной упорядоченности являются промежуточными структурами перед образованием двухмерных кристаллов. Это согласуется с тем, что диапазоны pH образования нитей и двухмерных кристаллов практически совпадают (табл. 1.16).
Для образования двухмерных кристаллов FjFo-АТРазы характерен узкий диапазон pH: 4,5-5,0. Типичные электронные микрофотографии таких кристаллов представлены на рис. 1.58 [596]. Максимальный линейный размер кристаллов составляет ~ 0,4 мкм. Как видно из микрофотографий, электронноплотные области, отвечающие белковым молекулам двухмерного кристалла, в проекции на плоскость мембраны образуют характерные полосы шириной ~ 12 нм. Расстояние между центрами полос составляет ~ 25 нм.
По данным оптической дифракции и Фурье-анализа, разрешение на
187
Рис. 1.58. Микрофотографии двухмерных кристаллов FiFQ-АТРазы а — монокристалл; 6 — мембранный фрагмент, содержащий несколько кристаллических областей с различной ориентацией решетки. Контрастирование 0,1%-ным водным раствором уранилацетата. Калибровка — 0,1 мкм
