Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 1.62. Микрофотографии препаратов а-латротоксина в форме двухмерных кристаллов (я) и одиночных молекул (б)
Контрастирование 1%-ным водным раствором ураннлацетата
кристаллизации обычно меняет лишь их относительное содержание. Такой полиморфизм может отражать динамику процесса кристаллизации, а также являться следствием существования нескольких конформаци-онностабильных состояний молекул белка. Параллельное структурное исследование различных кристаллических форм обычно является полезным при установлении и интерпретации их пространственной структуры.
Кристаллизация водорастворимых белков. В заключении раздела,
7. Проблема белка, т. 2 193
посвященного кристаллизации, следует сказать, что двухмерные кристаллы могут быть получены не только для интегральных мембранных белков, но и для некоторых водорастворимых, которые могут существовать в растворах в отсутствие детергентов. К ним относится а-латротоксин, являющийся основным токсическим компонентом яда паука каракурта. Этот белок состоит из идентичных негликозили-рованных полипептидных цепей, в состав каждой из которых входит 1041 аминокислотный остаток [607]. При негативном контрастировании гомогенного препарата а-латротоксин выявляется в виде частиц, имеющих размеры в пределах 10-15 нм (рис. 1.62,а).
При сохранении ряда общих черт частицы могут довольно значительно отличаться друг от друга, что свидетельствует о большой вариабельности ориентаций частиц токсина на пленке-подложке. Это затрудняет применение методов обработки одиночных изображений молекул в данном случае, так как для получения набора статистически достоверных проекций молекулы, соответствующих различным ориентациям частиц на пленке-подложке, потребовалось бы обработать большое количество изображений. С другой стороны, цифровая обработка электронно-микроскопических изображений упорядоченных образований белка могла бы существенно сократить время, необходимое для получения трехмерной структуры. Как правило, частицы а-латро-токсина равномерно распределены по подложке и адсорбируются на нее в произвольных ориентациях. Однако при высокой концентрации ионов Mg2+ (0,5 М) и в узком диапазоне pH (8,2-8,5) а-латротоксин агрегировал в двухмерные кристаллы, что наблюдалось при негативном контрастировании таких препаратов (рис. 1.62,6) [608].
Кристаллы имели размеры до 0,4 мкм, изображения некоторых из них давали отчетливую оптическую дифракцию, что позволило провести Фурье-фильтрацию изображений на ЭВМ с применением кристаллографических программ. На рис. 1.63,а представлена карта распределения контрастирующего вещества в элементарной ячейке кристалла после Фурье-фильтрации с разрешением 4 нм. Параметры ячейки а = h = 15,55 нм, у = 90°, соотношение между амплитудами и фазами рефлексов, а также высокие коэффициенты кросс-корреляции изображения самого с собой при его вращении на 90, 180 и 270° (рис.
1.63,6) позволяют заключить, что кристаллы принадлежат к двухсторонней плоской группе симметрии р4. С учетом симметрии было рассчитано распределение контрастирующего вещества в кристалле, контурная карта которого приведена на рис. 1.64.
Полученная проекция белковой части элементарной ячейки а-лат-ротоксина имеет вид квадрата со стороной около 11 нм, который имеет в центре минимум 2,5 нм в диаметре и восемь (четыре больших и четыре малых) максимумов белковой плотности. Наличие оси симметрии четвертого порядка указывает на то, что элементарная ячейка кристалла состоит из четырех одинаковых частей (4-, 8-, 12-...поли-пептидных цепей). Молекулярная масса протомера, по данным электрофореза и пептидного анализа, составляет 130 кДа. Расчет этого
194
а
б
Угол Вращения, град.
Рис. 1.63. Изображение одной элементарной ячейки двухмерного кристалла а-латротоксина после Фурье-фильтрации (а) и кривая автокорреляции этого изображения при вращении вокруг оси, проходящей через его центр (б)
Рис. 1.64. Изображение элементарных ячеек двухмерного кристалла а-лат-ротоксина после Фурье-фильтрации с учетом поворотной симметрии четвертого порядка
В каждой ячейке недоступная для контрастера область представляет собой квадрат со стороной 110 А и содержит четыре основных пика белковой плотности
параметра на основе структуры полноразмерного гена дает величину 157 кДа. Предполагая, что элементарная ячейка образована четырьмя протомерами с молекулярной массой 130-4 = 520 или 157 -4 = = 628 кДа, а также считая, что ее удельный парциальный объем близок к величине 1,3 А3/Да, получаем нижнюю оценку для толщины двухмерного кристалла - 5,6 и 6,7 нм соответственно. Для восьми полипептидных цепей (1040 или 1256 кДа) этот параметр будет составлять
11,2 и 13,4 нм. Большее количество протомеров не будет укладываться в данный объем, так как рассчитанные величины являются оценками снизу, а размеры белковых частиц не превосходят 15 нм.
Таким образом, полученная информация о симметрии кристаллов а-латротоксина указывает на то, что в состав его частиц, выявляемых
7* 195
