Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 1.45. Негативное контрастирование
170
на основе набора двухмерных проекций, полученных при съемке объекта под разными углами. Метод реконструкции может быть основан на хорошо знакомой из кристаллографии теореме проектирования, согласно которой двухмерная Фурье-трансформанта трехмерного распределения плотности (т.е. объекта) идентична центральному сечению трехмерной трансформанты, нормальному к направлению проектирования. Поэтому трехмерную Фурье-трансформанту объекта строят последовательно сечение за сечением, используя преобразования для различных направлений проектирования. Другими словами, применяя Фурье-трансформанты проекций, снятых под разными углами, можно построить трехмерную трансформанту объекта. Реконструкцию трехмерной структуры объекта получают повторным преобразованием Фурье-трансформанты подобно тому, как это делается при расчете трехмерной структуры в рентгеновской кристаллографии. Принципиальное отличие состоит лишь в том, что экспериментальными данными здесь являются не дифракционные картины, а изображения. Трансформанты изображений (проекций) получают путем математической операции двухмерного преобразования Фурье, в результате которого рассчитываются не только амплитуды, но и фазы структурных факторов. Поэтому для реконструкции трехмерной структуры задачи решения фазовой проблемы не возникает4.
Описанный подход к реконструкции трехмерной структуры требует превращения изображений в цифровую форму — двухмерную карту распределения оптической плотности и его последующего цифрового ’’процессинга”, например, преобразования Фурье с помощью ЭВМ. Начало развитию методов трехмерной электронной микроскопии было положено работой Д. Де-Розира и А. Клуга [577, 578], которые впервые применили цифровой процессинг изображений для изучения пространственной структуры бактериофага Т4. То обстоятельство, что благодаря высокой степени симметрии объекта многие наклонные проекции оказались идентичными, позволило рассчитать его структуру на основании единственного электронно-микроскопического снимка5. Для менее симметричных структур требуется большее количество проекций. Так, в случае экосаэдрических вирусов тем же авторам понадобилось объединить информацию, содержащуюся в трех снимках [579]. Большинство объектов исследования не обладает высокой собственной симметрией. Поэтому для реконструкции трехмерной структуры приходится собирать большие наборы их изображений, снятых с помощью электронного микроскопа в максимально широком диапазоне углов.
4 В том смысле, что экспериментальные данные уже содержат информацию о фазах. Однако проблема правильного и точного определения параметров существует всегда.
5 Для иллюстрации идентичности проекций симметричных объектов можно рассмотреть предельный случай симметричности — шар, любые проекции которого идентичны друг другу.
171
6.2. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ПЕРИОДИЧЕСКИХ СТРУКТУР
Обычно электронно-микроскопические изображения характеризуются высокой степенью ’’зашумленности”. Поэтому одинаковые проекции структуры молекул отличаются друг от друга различным прокрашиванием, зернистостью пленки-подложки, частичным искажением структуры и т.п. Для получения достоверной проекции необходимо усреднить многие изображения молекул, находящихся в одинаковой ориентации. Идеальной в этом отношении является микрофотография регулярно построенного объекта, например, двухмерного кристалла белка, которая содержит фактически много изображений одного и того же повторяющегося элемента (рис. 1.46). Главное отличие такого кристалла от обычного трехмерного состоит в том, что его толщина в направлении, перпендикулярном изображению, равна высоте образующих его молекул, т.е. одной элементарной ячейки.
Для получения усредненного профильтрованного от шумов изображения иногда используют оптический дифрактометр (рис. 1.47). Благодаря периодической структуре объекта вся полезная информация о нем содержится в регулярно расположенных дифракционных максимумах. Нерегулярная часть структуры образца — шум — дает дифракционные максимумы, располагающиеся вне узлов решетки. Можно ’’отфильтровать” шумовую составляющую исходного изображения, используя для формирования изображения только лучи, проходящие через узлы решетки, поместив в плоскость дифракционной картины ’’маску” — непрозрачный перфорированный экран, пропускающий только эти лучи.
Оптическая фильтрация легко осуществима на практике. Главное ограничение здесь качество перфорированного экрана. ’’Шумовые” максимумы дифракции иногда располагаются очень близко от основных и поэтому их перекрывание ’’маской” на практике оказывается невозможным. Наиболее эффективно отфильтровывают изображения периодических объектов с помощью ЭВМ [580]. Для этого участок изображения, используя денситометр, переводят в цифровую форму, превращая его в двухмерный набор оптических плотностей. Затем с помощью преобразования Фурье рассчитывают дифракционную картину от выбранного участка изображения. Как уже отмечалось выше, такой расчет дает как амплитуды, так и фазы дифрагированных лучей. Ее анализ позволяет выбрать наиболее интенсивные и регулярно расположенные максимумы, опираясь на которые можно определить параметры дифракционной решетки и произвести индексирование расположенных в ее узлах максимумов, т.е. приписать им соответствующие индексы Миллера — /г и &б. Для проведения качественной фильтрации надо детально (рис. 1.48) проанализировать выбранные дифракционные максимумы, что делают с помощью так называемых
