Проблема белка. Том 2: Пространственное строения белка - Попов Е.М.
ISBN 5-02-001697-7
Скачать (прямая ссылка):
166
подавляющее большинство метальных групп (свыше 85%) находится в ориентациях, отвечающих минимумам торсионного потенциала.
Рентгеноструктурный анализ усложняется тем, что рентгеновские лучи являются ионизирующим излучением, что приводит при нормальной температуре к быстрому разрушению кристалла. Это обстоятельство требует частой замены экспонируемого образца и введения при обработке опытных данных специальных поправок, ведущих к дополнительным ошибкам.
Нейтроны — незаряженные частицы. В дифракционных экспериментах длина волны нейтронного потока должна быть того же порядка, что и длины валентных связей. В рентгеноструктурном анализе обычно используют медное излучение с \ = 1,54 А. Нейтроны с длинами волн такого порядка испускаются при температуре -100° и называются тепловыми. Они имеют значительно более низкую энергию (0,025 эВ) по сравнению с рентгеновским излучением (10 000 эВ) и не разрушают кристаллы белков, поэтому набор дифракционных данных для нейтронов можно получить от одного кристалла, что является несомненным достоинством метода. Недостаток метода нейтронной дифракции — малая интенсивность потока частиц. Распределение скоростей нейтронов, из которого вырезается монохроматический поток, отвечает кривой Максвелла. Интенсивность первичного потока нейтронов по крайней мере на два порядка слабее характеристического излучения рентгеновской трубки. Выше отмечалось, что способность атомов рассеивать нейтроны существенно не зависит от порядкового номера в Периодической системе элементов Менделеева. Поэтому метод изоморфного замещения с использованием тяжелых атомов бесполезен в нейтроноструктурном анализе белков. Альтернативный подход к решению фазовой проблемы еще не найден. В связи с этим для расшифровки нейт-ронограмм необходимо использовать данные рентгеноструктурного анализа. К настоящему времени с помощью метода нейтронной дифракции в комбинации с рентгеноструктурным анализом получены полные трехмерные структуры следующих пяти белков: трипсина, лизоцима, миоглобина, рибонуклеазы и крамбина (разрешение 2,2; 2,2; 1,4; 2,8 и 1,3 А соответственно; ошибка в определении координат < 0,3 А) [548].
Глава 6 ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ БЕЛКОВ
Одним из методов, позволяющих получать важную структурную информацию, является электронная микроскопия [576]. Этот метод больше других способствовал пониманию клеточной морфологии и структуры клеточных органелл. Возможность получения непосредственного изображения с большим увеличением широко используется почти во всех областях биологии и материаловедения. Однако метод
167
имеет ряд ограничений, особенно в случае применения его к биологическим объектам. Во-первых, реальное разрешение на биологических объектах обычно не превышает ~ 15 А, хотя предельное разрешение современных электронных микроскопов достигает величины ~ 2,0 А. Во-вторых, при исследовании макромолекул серьезные трудности связаны с контрастностью образцов и их стабильностью в условиях глубокого вакуума и облучения пучком ускоренных электронов3. Кроме того любое электронно-микроскопическое изображение представляет собой двухмерную проекцию трехмерного объекта на плоскость фотопластинки.
В последние годы электронная микроскопия молекулярных уровней разрешения бурно развивается. С одной стороны, непрерывно совершенствуется приборная база. Появились микроскопы, позволяющие проводить съемки при низких и сверхнизких температурах, что уменьшает радиационное повреждение биологических объектов. Расширился диапазон ускоряющих напряжений и созданы электронные устройства, минимизирующие облучение образца. С другой стороны, благодаря развитию вычислительной техники появился целый спектр методов цифровой обработки изображений. Применение компьютеров позволяет по-новому подойти к проблеме увеличения контрастности изображений и перейти к трехмерной электронной микроскопии, т.е. синтезированию пространственных изображений исследуемых объектов на основе их проекций.
Яркой демонстрацией возможностей современной электронной микроскопии является установление пространственной структуры бактериородопсина первоначально с разрешением ~ 7 А, а впоследствии ~ 3 А. Это означает, что электронно-микроскопические методы могут в отдельных случаях приближаться по своей информативности к рентгеноструктурному анализу.
6.1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ МЕТОДА
Теоретические принципы, лежащие в основе световой микроскопии, справедливы и для электронной, а электронный микроскоп во многих отношениях аналогичен световому. Длина волны электронного пучка зависит от величины ускоряющего напряжения. Так, при 50 кВ она равна 0,054 А, а при 1000 кВ — 0,0087 А, т.е. короче рентгеновского излучения и поэтому можно было бы ожидать, что такой микроскоп будет давать изображение с большим разрешением по сравнению с рентгеновской дифракцией. Однако по техническим причинам это неосуществимо и лучшие современные электронные микроскопы дают разрешение ~ 2,0 А.
3 Электроны обладают более разрушительным действием по сравнению с рентгеновским излучением. Минимальные дозы облучения, необходимые для регистрации изображения, в тысячи раз превышают дозы рентгеновского излучения, необходимые для регистрации дифракции, например, от белковых кристаллов.
