Физиологически активные полимеры - Платэ Н.А.
Скачать (прямая ссылка):
Таким образом, переход от нативных ферментов к их дек-страновым или другим полимерным конъюгатам позволяет увеличивать время сохранения ферментативной активности плазмы крови. Пока не ясно, какой из двух механизмов клиренса — гломерулярная фильтрация или захват клетками печени — участвует в наблюдаемых изменениях; вполне возможно, что оба. Задача химика — найти такую структуру конъюгата, которая позволяла бы достаточно долго сохранять ферментативную активность циркулирующего фермента.
Среди конъюгатов ферментов с декстраном, полученным иными, чем приведенные выше, методами, можно отметить конъюгаты нуклеаз, синтезированных алкилированием полисахарида .м-нитробензилоксиметилпиридинием с последующим восстановлением нитрогрупп, диазотированием и азосочетанием с белком [70]. Конъюгаты такого типа существенно стабильнее исходных ферментов как при хранении, так и при внутрнбрю-шинном введении животным.
Конъюгаты декстрана, активированного 2-амино-4,6-дихлор-1,3,5-триазином с трипсином, имели достаточно высокую активность по отношению к высокомолекулярным субстратам — казеину и фибрину (28—52 % от активности исходного фермента), их конформационная стабильность сохранялась на уровне исходного фермента, а стабильность к автолизу была повышена [71]. Причина, видимо, заключалась в том, что число связей между ферментом и полимером было относительно небольшим, а пространственно жесткий триазиновый цикл играл в этом случае роль «вставки».
Модификацией растворимой карбоксиметилцеллюлозы (М = 17 тыс., у = 85) а-химотрипснном был получен гетерогенный конъюгат (5.15) [72] с измененными по сравнению с исходным ферментом свойствами.
Р—ОСН2СООН (5.16)
ch2n2
n2h«.h2o
Р—ОСН2СООСН3
NaN02
—»¦ Р—OCHaCONHNH2 -----------*- Р—0CHSC0N3
Б—NH2
(5.17)
—> Р—OCHjCONH—Б (5.15)
Переход от карбоксиметилцеллюлозы (5.16) к ее азиду (5 17) сопровождался побочными реакциями и образованием нерастворимых продуктов. Растворимый азид (5.17) имел М — 11,4 тыс. и составлял только половину продукта реакции. Свойства конъюгата существенно отличались от свойств исходного фермента.
Аспарагиназу связывали с растворимой низкомолекулярной карбоксиметилцеллюлозой (М ж 17 тыс.) азидным методом [73]. Авторам удалось выделить фракцию с высоким содержанием белка, активность которой составляла «40% от активности исходного фермента; при этом pH-оптимум был смещен незначительно, а термическая стабильность и стойкость к про-теолизу повышены. Конъюгат той же аспарагиназы (5.18) с декстраном был синтезирован эпоксидным методом [74]:
он- б—nh2
Д—ОСН2СН(ОН)СН2Вг ------> Д—OCHjCH—СНг ----------»
\ /
О
—-> Д—OCH2CH(OH)CH2N Н—Б
(5.18)
Переход от фермента к конъюгату сопровождается повышением термостабильности и изменением иммунологической специфичности, причем в количественном отношении эти характеристики зависят от содержания декстрана в конъюгате.
Восстановленные конъюгаты аспарагиназы из Erivinia Carlovara с диальдегиддекстраном были синтезированы из дек-странов с М— 10, 40 и 70 тыс. [75]. Они показали пониженную иммунореактивность, которая зависит от М исходного декстрана. Защита белка от взаимодействия с антителами возрастает с увеличением М, одновременно снижается гиперчувствительность животных к ферменту как антигену. Время циркуляции в кровяном русле заметно повышается по сравнению с временем циркуляции нативного фермента.
Конъюгаты пепсина и карбоксипептидазы А получены присоединением n-фенилендиамина к декстрану бромциановым методом и связыванием ферментов с полученным полимером с помощью водорастворимого карбодиимида [76]. Ароматическое аминопроизводное декстрана перед конъюгацией с белком и сами конъюгаты подвергали фракционированию по размерам молекул. Активность конъюгатов была близка к актийности исходных ферментов, профили pH-активности не изменялись. Ферментативные свойства отдельных фракций мало отличались друг от друга, а также слабо зависели от М исходного декстрана. Сольватационные свойства конъюгатов существенно ближе к свойствам декстрана, чем к свойствам ферментов. Это указывает на определяющее влияние полисахаридной оболочки
на гидродинамические свойства конъюгатов, которые соответствуют высокоразветвленным полимерам, в то время как исходные декстраны — практически линейные макромолекулы. Поэтому конъюгаты, полученные бромциановым методом, можно рассматривать как жесткие белковые глобулы, окруженные подвижной оболочкой из разветвленных полисахаридных цепей. В результате сохраняется возможность для ферментативных реакций с высокомолекулярными субстратами.
Стабилизация белков в полисахаридных конъюгатах вызывается несколькими факторами. Один из них, несомненно, заключается в сшивании белка (наложение «скобок», см. выше), другой был выявлен на примере фиколла-70 (сахароза, сшитая эпихлоргидрином). О-Метилирование полимера-носителя, т. е. повышение его гидрофобности, приводило к дестабилизации белка (щелочной фосфатазы) в конъюгате, полученном бромциановым методом, по отношению к тепловой денатурации [77]. В то же время конъюгаты с самим фиколлом или О-ацетилфи-коллом были стабильнее, чем исходный фермент. При этом все три конъюгата сохраняли примерно в одинаковой мере ферментативную активность (84—89 % от исходной). По-видимому, гидрофильные полисахариды помимо ковалентных связей образуют в конъюгате с белком множественные внутримолекулярные водородные связи, которые и приводят к закреплению конформации. Наконец, третий стабилизирующий фактор связан с затруднением агрегации белковых глобул перед выпадением в осадок (денатурацией) в результате наличия гидрофильной полимерной оболочки. Гидратация белка, вероятно, не менее существенна для стабилизации. Об этом свидетельствуют результаты термостабилизации р-галактозидазы, связанной с декстраном, О-метилдекстраном и О-ацетилдекстраном [78]. Устойчивость этих конъюгатов к протеолизу возрастает только в случае гидрофильного носителя. По-видимому, цепи более гидрофобного носителя — метилированного декстрана — образуют менее компактную оболочку вокруг белковой глобулы и создают меньше препятствий для протеолиза.
