Физиологически активные полимеры - Платэ Н.А.
Скачать (прямая ссылка):
ридов, хотя четких доказательств полного выведения из организма полисахарнд-белковых конъюгатов или их фрагментов пока нет. Более того, известно, что хотя сами полисахариды (декстран, крахмал) способны к ферментативной биодеструк-цин, химическая модификация ухудшает их свойства как субстратов соответствующих ферментов. Так, О-(2- или 6-гидрокси-этил) крахмал расщепляется амилазой медленнее, чем сам крахмал (см. гл. 1), а Сефадекс медленнее, чем декстран [14]. Распределение в организме (в том числе выведение через почки) модельных производных декстрана или их фрагментов существенно зависит от способа модификации полисахарида [42]. Тем не менее имеющиеся данные по полисахарид-белковым конъюгатам указывают на то, что именно полисахариды наиболее пригодны для получения полимер-белковых конъюгатов медицинского назначения [13].
Сам по себе декстран может реагировать с белками только по концевой альдегидной группе — единственной на макромолекулу. Практического значения эта реакция не имеет. Поэтому декстран, как и другие водорастворимые полисахариды (крахмал, карбоксиметилцеллюлозу), переводят в функциональные производные («активируют»), как описано в гл. 3. Для получения белковых конъюгатов полисахаридов (главным образом декстрана) в основном используют три метода: альдегидный (через диальдегидполисахарид), бромциановьгй и триазиновый.
Диальдегиддекстран относительно стабилен, легко реагирует с аминогруппами белка в мягких условиях (pH = 7—9, 20°С) и сам по себе сшивок не образует. Он способен к неферментативной деструкции в организме. Восстановление альдиминовых связей боргидридом после реакции с белком позволяет получать стабильные конъюгаты полисахарида с белком. Отрицательный заряд может быть введен в полимер-носитель в результате обработки невосстановленного конъюгата бисульфитом [43], а положительный — хлоргидратом гндроксиламина с последующим восстановлением [34]. Действие гндроксиламина сопровождается разрывом значительного числа альдиминовых связей в результате переаминированйя.
+ Б—NH2 —»
yCH=N—Б ^СНО
Реакция диальдегиддекстрана с аминами достаточно эффективна, и в подходящих условиях удается связать весь введен-
ный в реакцию белок, что позволяет отказаться от препаративного разделения реакционной смеси. К недостаткам диальде-гиддекстрана относится трудность регулирования его М. Однако для конъюгатов, в которых полимер-носитель сшивается белком, это не столь существенно.
Бромциановый метод активации декстрана для связывания белков имеет ряд особенностей. Главная из них заключается в необходимости максимально ограничить число сшивок в активированном полисахариде. Поэтому декстран, желательно небольшой молекулярной массы, приходится активировать в разбавленных растворах при возможно более низком pH (7,5—9). Для получения достаточно реакционноспособного полимера количество бромциана должно быть минимальным. По тем же причинам взаимодействие активированного полимера с белком должно происходить в мягких условиях, а непрореагировавшие активные группы следует дезактивировать избытком низкомолекулярного амина. При этом происходит разрыв части сшивок. Углеводная компонента конъюгата имеет разветвленную структуру в результате сшивания полисахаридных цепей друг с другом. Это важно как для возникновения антигенности, так и для биодеструктируемости. Поэтому говорить о сохранении специфической структуры декстрана в его конъюгатах, полученных бромциановым методом, можно только с большими оговорками. В действительности полимер-белковые конъюгаты представляют собой в этом случае гетерогенную (по структуре и функции) смесь высокомолекулярных агрегатов. Варьировать степень модификации полимера при бромциановом методе трудно, воспроизводимость результатов (по структуре продуктов реакции) также оставляет желать лучшего. Тем не менее простота и высокая эффективность метода обусловили его широкое распространение.
Применение трихлортриазина и аминодихлортриазинов для активации декстрана во многом аналогично применению бромциана. Триазины менее активны, атомы хлора в них имеют разную реакционную способность. Реакцию с белком проводят при pH от 9,0—9,2.
В табл. 5.1 приведены ферменты, присоединенные к дек-страну альдегидным, бромциановым и триазиновым методами, и указана степень сохранения ферментативной активности в полученных конъюгатах. Активность конъюгатов зависит от многих трудно учитываемых факторов. Так, при альдегидном методе существенны М диальдегиддекстрана, особенно наличие низкомолекулярных фракций, число активных групп в полимере и pH связывания белка, при бромциановом методе — М исходного декстрана, соотношение бромциан : декстран, pH активации и взаимодействия с белком, а также ряд других показателей, которые полностью определяют результаты реакции. Схожая картина наблюдается и при триазиновом методе. При разных
Исходный фермент и его источник
Метод
получения
