Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Процесс разделения коинтеграта осуществляется с помощью гомологичной рекомбинации или при участии сайт-специфической рекомбиназы (резолъвазы), которая кодируется транспозоном и распознает специфические последовательности (res). В процессе $ксцизионной транспозиция сайт-специфическая эндонуклеаза (интеграза) при участии других белковых факторов вырезает транспозон из репликона-донора, восстанавливая кольцевую структуру репликона. При этом одновременно образуется кольцевой ковалентно замкнутый мобильный элемент в качестве промежуточного соединения, который встраивается в репликон-реципиент. Наконец, в процессе ретротранспозиции имеет место транскрипция ретротранспозона с образованием РНК, содержащей интрон группы II, который с участием матуразы удаляется из исходной РНК и интегрируется в безинтронную РНК, не обязательно того же вида, что и РНК-донор (обратный сплайсинг). Далее РНК-реципиент с помощью обратной транскрипции превращается в кДНК и интегрируется в репликон-реципиент по механизму RecA-зависимой гомологичной рекомбинации. Альтернативно, в редких случаях, интрон-содержащий транскрипт ретротранспозона, может с помощью обратного сплайсинга встраиваться в одну из цепей расплетенной двухцепочечной ДНК-реципиента. После внесения во вторую цепь ДНК одноцепочечного разрыва с помощью эндонуклеазы, образовавшийся 3'-конец ДНК служит местом инициации обратной транскрипции на матрице интегрированной РНК, что приводит в конечном счете к образованию двухцепочечной ДНК со вставкой последовательности ретротранспозона. Всеми тремя активностями: обратной транскриптазы, матуразы и эндонуклеазы обладает белок, кодируемый геном iep (intron encoded protein), локализованный в интроне ретротранспозона.
По выбору мест интеграции в репликон-реципиент транспозоны разделяют на три группы. Некоторые из них, наподобие Тп5 и бактериофага Ми, интегрируют в геном случайным образом, другие встраиваются в ограниченное число участков ДНК, для третьих характерна сайт-специфическая интеграция. Именно способность ряда транспозонов встраиваться случайным образом в геном клетки-хозяина часто используется в современной молекулярной генетике для клонирования неизвестных последовательностей и картирования генома.
Встраивание транспозона в кодирующую часть гена в результате транспозиции, как правило, его инактивирует, что сопровождается развитием соответствующего фенотипа. Фрагмент ДНК с транспозоном может быть выделен из клонотеки последователь-
ностей с помощью зондов, для создания которых используются последовательности транспозона. Поскольку последовательности транспозонов, используемых в такой работе, известны, не представляет труда с помощью подходящих рестриктаз выделить транспозон вместе с фланкирующими его неизвестными последовательностями нуклеотидов. С помощью набора рестриктаз можно построить детальную физическую карту неизвестных последовательностей, прилегающих к интегрированному транспозону, и осуществить дальнейшее продвижение в сторону неизвестных последовательностей в обе стороны от транспозона. Такой подход включает в себя элементы позиционного клонирования, принципы которого будут рассмотрены ниже в разделе 4.2.
3.2. Векторы на основе хромосомы фага X
Основным недостатком плазмидных векторов для клонирования является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Размер вставок клонируемой ДНК в плазмидных векторах, которые способны стабильно в них существовать, как правило, не превышает нескольких тысяч пар оснований. Большие вставки ДНК в векторных плазмидах нестабильны, и их размеры постепенно уменьшаются по мере увеличения числа раундов репликации таких рекомбинантных плазмид in vivo. Выраженное делетирование чужеродной ДНК в плазмидах большого размера связано с тем, что в бактериальных клетках селективное преимущество получают те плазмиды, время репликации которых минимально. Поэтому нуклеотидные последовательности ДНК, не участвующие в репликации векторных плазмид, постепенно элиминируются посредством делеций при длительном культивировании рекомбинантных бактерий.
Емкость клонирующих векторов была значительно повышена с появлением векторов, сконструированных на основе хромосомы бактериофага X. Получившие широкое распространение векторы серий Charon, Xgtll и XEMBL обладают, по крайней мере, двумя существенными преимуществами перед плазмидными векторами. Во-первых, векторы на основе ДНК фага X обладают значительно большей емкостью, в них можно клонировать фрагменты ДНК длиной от 5 до 25 т.п.о. Во-вторых, фаговые частицы, содержащие упакованную ДНК, способны проходить литический цикл развития внутри бактериальных клеток и поэтому образовывать стерильные пятна (бляшки) на газоне бактерий. Такие бляшки содержат в концентрированном виде как сами фаговые
рис. 7. Упаковка рекомбинантной фаговой ДНК в фаговые частицы in vitro
рис. 8. Генетическая карта хромосомы бактериофага X -
EMBL3
а - расположение генов на хромосоме; 6 - шкала длины хромосомной ДНК в процентах от длины X ДНК и т.п.о.; в - участок генома, замещаемый на клонируемый фрагмент ДНК соответствующего размера. S, В и R - сайты рестрикции SalGl, BamHl и EcoRl, соответственно
