Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Помимо генов устойчивости к антибиотикам в качестве селектируемых маркеров используют и другие гены или их фрагменты. В частности, для этих целей часто применяются гены различных ферментов, присутствие которых в клетках в составе плазмиды обнаруживают по появлению соответствующей ферментативной активности. В часто используемых векторах серии pUC таким селектируемым маркером является 5'-концевая часть гена р-галактозидазы Е. coli - lacZ' (см. рис. 6, б). Эта часть гена, находящаяся под контролем 1ас-промотора, кодирует N-конце-вую часть р-галактозидазы (так называемый а-пептид), которая путем объединения с недостающей С-концевой частью полипептида без образования пептидной связи восстанавливает ферментативную активность р-галактозидазы. р-Галактозидаза обладает способностью расщеплять искусственный субстрат Xgal (5-бром-4-хлор-3-индолил-1)-галактопиранозид) с образованием окрашенного в голубой цвет продукта реакции. В том случае, когда в бактериальных клетках, которые содержат в хромосоме недостающую экспрессирующуюся 3'-концевую часть гена lacZ и выращиваются на среде с Xgal, в результате комплементации а-пептидом вектора появляется активность р-галактозидазы, образованные этими клетками бактериальные колонии окрашиваются в голубой цвет. Уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК локализованы в начале гена р-галактозидазы в составе полилинкера (синтетической последовательности нуклеотидов, содержащей несколько перекрывающихся уникальных сайтов рестрикции), который не нарушает функциональной целостности последовательности нуклеотидов а-пептида. Вставка рекомбинантной ДНК в эти векторы разрывает структурную часть гена р-галактозидазы и инактивирует его, в связи с чем колонии бактерий с подобными рекомбинантными плазмидами, выросшие на питательной среде с Xgal, не окрашены. Поскольку
в
Eall
'Pvu II TthUW
Nacl
Т7-промотор
Полилинкер
ТЗ-промотор
PvwII
Место расщепления тромбином
Место расщепления энтерокиназой
tmoeabjea'Tco'Va, < < Sc < 4,05 a.
Терминатор транскрипции Р-глобинового гена кроликов
векторы серии pUC одновременно содержат и ген устойчивости к
tMnHijmumHy, отбор бактерий, несущих рекомбинантные плаз-иды, можно проводить одновременно по этим двум маркерам. На питательной среде с ампициллином и Xgal вырастают только бактерии, устойчивые к антибиотику, т.е. содержащие плазмиду pUC, а среди выросших колоний лишь неокрашенные содержат вставку чужеродной ДНК. В качестве селектируемых маркеров в векторных молекулах часто используются гены, присутствие которых может быть обнаружено косвенно по комплементации генетических дефектов бактериальных клеток-хозяев, что делает их жизнеспособными в определенных селективных условиях. Подробнее об одной из таких систем см. в разделе 7.3.3.
Плазмиды серии Bluescript. За короткий период развития генной инженерии было сконструировано труднообозримое количество векторных плазмид, обеспечивающих конкретные потребности исследователей. Одной из вершин генно-инженерного искусства, прекрасно иллюстрирующей возможности генной инженерии, в настоящее время являются полифункциональные векторы серии Bluescript, полученные фирмой “Stratagene” (США) (см. рис. 6, г). Вектор Bluescript М13+ представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК длиной около 3 т.п.о. Он включает в себя ген устойчивости к ампициллину Атрт, ген р-галактозидазы lacZ, в N-концевую часть которого встроен полилинкер, содержащий уникальные сайты рестрикции для 21 рестриктазы, промоторно-операторную область lacZ, а также ген lac-penpeccopa lacl. В результате встраивания клонируемого фрагмента ДНК в полилинкер происходят разрыв кодиру-
Рис. 6. Различные плазмидные векторы для клонирования ДНК и их рестрикционные карты
Обозначены положения уникальных сайтов рестрикции, а также функционально значимых генов
а - векторная плазмида pBR322; б - экспрессирующая векторная плазмида pUC18; в - векторная плазмида 7CAN7, предназначенная для отбора рекомбинантных клонов с использованием гомологичной рекомбинации; г - многофункциональная векторная плазмида Bluescript; д - вектор pTriEx-4 Ek/LIC (Novagen, США), используемый для клонирования ДНК без применения ДНК-лигазы с последующей кратковременной экспрессией клонированных генов в клетках животных. LIC - участки вектора, содержащие липкие концы; S- HSV и His-tags - последовательности, кодирующие аффинные пептидные метки (см. табл. 5); CMV и lilac и polh - промоторы цитомегаловируса, Т7-РНК-полиме-разы (гибрид с /ас-промотором) и гена полигедрина бакуловирусов для транскрипции клонированных генов в клетках млекопитающих, бактерий или насекомых, соответственно; цифры внутри ОРС соответствуют нумерации нуклеотидов в молекуле вектора
ющей части гена lacZ и инактивация (3-галактозидазы, что, как и в случае вектора pUC18, можно обнаружить по исчезновению окраски колоний бактерий, содержащих этот вектор со вставкой клонированной ДНК. Кроме того, встроенный в полилинкер фрагмент ДНК попадает под контроль промоторно-операторной регуляторной последовательности гена lacZ и в присутствии индуктора IPTG может быть экспрессирован в клетках Е. coli. В дополнение к этому полилинкер в векторной плазмиде содержит на одном конце промотор для Т7-, а на другом - для ТЗ-РНК-поли-мераз, которые ориентированы навстречу друг другу, что позволяет транскрибировать любую из цепей клонированного фрагмента ДНК in vitro с помощью той или другой РНК-полимеразы и получать препаративные количества мРНК или же комплементарной ей антисмысловой РНК. Кроме того, вектор Bluescript М13+ обладает межгенной областью (IG) фага fl, родственного фагу М13. Эта область детерминирует все цис-действующие функциональные последовательности нуклеотидов фага, необходимые для репликации его хромосомы и упаковки ее в фаговые частицы. В присутствии фага-помощника М13 происходит преимущественная упаковка образовавшейся в результате репликации одноцепочечной плазмиды в фаговые частицы М13. ОцДНК Bluescript М13+ после очистки может быть использована непосредственно для секвенирования клонированной ДНК или проведения сайт-специфического мутагенеза. Векторы типа Bluescript М13+, способные существовать либо в виде плазмиды, либо в составе фаговых частиц нитевидных бактериофагов, называют фагмидами.
