Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
HindlU ВатШ
б
Плазмидный
1охР^ репликон
Г BgXreP
ampR 1 pNS582 1
PBR322V х BgX“J^kanR
ori ^ i^eplyt
BamHl
Sacl Sacl
sacBll
ВатШ Sacl
Полилинкер pUC19__ loxP
sacBll
Репликон литического PI
rep lyt
рас
Плазмидный
репликон
rep
kanR
ДНК, по которому производится клонирование. В этом фрагменте имеются типичный полилинкер, а также два уникальных сайта рестрикции HindllI и BamHl, фланкированные промоторами Т7- и §|>6-РНК-полимераз. Такие промоторы могут быть использованы Для получения РНК-зондов, необходимых для осуществления Прогулок по хромосомам”, а также прямого секвенирования кло-*®рованной ДНК в месте стыковки с вектором. Кроме того, во фрагменте имеется сайт cosN, обеспечивающий расщепление вектора со вставкой в уникальном месте с помощью терминазы фа-Р8 А, без применения ферментов рестрикции. Этот фермент ис-^Рльзуется бактериофагом для специфического разрезания конка-?|Меров своей хромосомы при упаковке в фаговые частицы. Для т®й же цели может быть применен и сайт loxP бактериофага Р1,
который является мишенью для фаговой эндонуклеазы Сге. Эти сайты используются для получения специфических концов клонированной ДНК с целью ее дальнейшего рестрикционного картирования путем введения концевой метки с последующим неполным расщеплением рестриктазами и электрофоретическим разделением образовавшихся фрагментов.
Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. coli с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YAC. Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от YАС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F'-факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами “снизу вверх”. Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения.
Искусственные хромосомы Р1. В заключение следует упомянуть о семействе векторов РАС (PI-derived artificial chromosome), также часто используемых в современных исследованиях. Векторы этой серии содержат гены умеренного бактериофага Р1, обеспечивающие репликацию фаговой хромосомы в зараженных бактериальных клетках. Рекомбинантные ДНК на их основе (размер вставки 150-200 т.п.о.) также вводятся в бактериальные клетки с помощью электропорации.
Бактериофаг Р1, заражающий клетки Е. coli так же, как и ко-дифаг X, относится к категории умеренных, т.е. способен длительное время существовать в зараженных клетках в скрытом виде как йрофаг. Однако, в отличие от бактериофага X, который во время скрытого (лизогенного) состояния встраивает свою хромосому в хромосому бактерии-хозяина, фаг Р1 поддерживает хромосому в цитоплазме бактериальных клеток в виде кольцевой ковалентно замкнутой молекулы, напоминающей плазмиду, размер которой составляет 100 т.п.о. Размер репликона, который способен обеспечивать репликацию хромосомы Р1 в лизогенном состоянии, составляет всего 1,5 т.п.о. Этот сегмент ДНК содержит область начала репликации oriR длиной в 245 п.о., ген г ер А, кодирующий белок-цнициатор репликации (286 а.о.), а также последовательность incA длиной в 285 п.о., которая осуществляет контроль репликации.
Структура одного из классических векторов семейства РАС (pNS582) представлена на рис. 11, б [107]. Вектор состоит из двух доменов, фланкированных последовательностями сайт-специфи-ческой рекомбинации фага PI 1охР, ориентированными в одном и том же направлении. Рекомбинация между ними с участием Р1-Сге-рекомбиназы, которую кодирует бактериальная клетка-хозя-ин, приводит к разделению доменов с образованием двух кольцевых молекул. Один из доменов содержит ген устойчивости к ампициллину атрг, многокопийный репликон плазмиды pBR322 и рас-сайт бактериофага, обеспечивающий упаковку ДНК в его головку. Второй домен вектора обладает плазмидным Р1-репликоном, функционирующим во время лизогенного состояния бактериофага, литическим Р1-репликоном, который находится под контролем /ас-промотора, геном устойчивости к канамицину капг, кодирующим аминогликозид-З'-фосфотрансферазу, и полилинкером. Использование двух репликонов фага Р1 позволяет поддерживать вектор со вставкой в виде 1-2 копий при конструировании клоно-гек последовательностей, а после индукции /яс-промотора IPTG Повышать количество копий вектора в ~25 раз как следствие функционирования литического репликона, обычно используемого фагом для интенсивной репликации хромосомы во время литического цикла развития при образовании фаговых частиц.
