Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
GGACTAGTCC 10 10 >90
CGGACTAGTCCG 12 0 50
CTAGACTAGTCTAG 14 0 50
Таблица 3 (окончание)
Рестриктаза Последовательность Длина Процент расщепления
олигонуклеотидов цепи,нт олигонуклеотида после
в окрестностях сайта инкубации в течение
2ч 20 ч
Sphl GGCATGCC 8 0 0
CATGCATGCATG 12 0 25
ACATGCATGCATGT 14 10 50
Xbal CTCTAGAG 8 0 0
GCTCTAGAGC 10 >90 >90
TGCTCTAGAGCA 12 75 >90
CTAGTCTAGACTAG 14 75 >90
Xhol CCTCGAGG 8 0 0
CCCTCGAGGG 10 10 25
CCGCTCGAGCGG 12 10 75
Примечание. Жирным курсивом выделены последовательности сайтов
рестрикции.
определенных рестриктаз расщеплять сайты рестрикции от количества фланкирующих сайт нуклеотидов. Данное свойство рестриктаз объясняют, в частности, тем, что на самих концах молекулы дцДНК происходит локальное плавление двойной спирали ДНК с образованием коротких одноцепочечных участков, захватывающих сайт узнавания рестриктазами. Частично избежать локальное плавление можно понижением температуры реакционной смеси во время проведения рестрикции таких олигонуклеотидов. Поскольку эти данные имеют большое значение для практической генной инженерии, они суммированы в табл. 3.
Проблема возможности изменения субстратной специфичности рестриктаз методами белковой инженерии обсуждается в разделе 3.6.2. второй части книги.
2.2.6. Изменение концов рестрикционных фрагментов ДНК
Часто из-за особенностей первичной структуры в клонируемой ДНК или векторе отсутствуют сайты рестрикции, необходимые для их соединения. Для преодоления этих затруднений, связанных с этим обстоятельством, разработан ряд методов, позволяющих изменять последовательности нуклеотидов на концах фрагментов ДНК, образованных эндонуклеазами рестрикции. Прежде всего, можно “затупить” липкие концы путем заполнения их нуклеотидами с помощью ДНК-полимеразы в том случае, если одноцепочечный участок является 5'-выступающим. При наличии
3'-выступающих концов их “затупляют” с помощью нуклеаз, специфичных в отношении оцДНК, а также ДНК-полимераз, обладающих 3' —> 5'-корректирующей экзонуклеазной активностью (см. ниже).
К тупым концам фрагментов ДНК можно присоединять короткие двухцепочечные олигонуклеотиды, называемые линкерами, которые содержат требуемый сайт рестрикции. По завершении лигирования по тупым концам линкера и фрагмента ДНК для получения липких концов образовавшиеся гибридные фрагменты инкубируют с рестриктазой, специфичной в отношении сайта рестрикции линкера.
Для замены одного липкого конца на другой используют двухцепочечные олигонуклеотиды, называемые адаптерами, состоящими из двух частично перекрывающихся олигонуклеотидов, которые по обеим сторонам образуют одноцепочечные липкие концы. Один из них соответствует липкому концу фрагмента ДНК, а другой обладает требуемой последовательностью нуклеотидов.
2.2.7. ДНК-метилазы и урацил-ДНК-гликозилазы
Большинство штаммов Е. coli содержит два типа ферментов, метилирующих ДНК независимо от систем рестрикции-модифи-кации: Dam- и'Dcm-метилазы, которые контролируют уровень экспрессии некоторых генов и репликацию бактериальной ДНК, а также метят родительскую цепь ДНК, что необходимо для правильной коррекции ошибочно спаренных нуклеотидов во время репарации ДНК [80]. Dtfm-метилазы осуществляют перенос метальных групп в Ыб-положение аденина (N6mA) в последовательности GATC. В таком случае многие рестриктазы (например, ВсЛ, Mbol или Clal), в состав сайтов рестрикции которых входит данная метилированная последовательность, перестают расщеплять ДНК по этим сайтам. Аналогичное действие на некоторые рестриктазы, например ?coRII, оказывают и Dcm-метилазы, осуществляющие метилирование остатков цитозина в положении С5 (5шС) в последовательностях CMeCAGG и CMeCTGG. Для того чтобы избежать нежелательного влияния этих метилаз на клонируемые ДНК, в качестве хозяев используют мутантные штаммы E.coli: dam- и dcm~. ДНК-метилазы применяют для блокирования in vitro соответствующих сайтов рестрикции на исследуемых фрагментах ДНК с целью получения под действием гомологичных рестриктаз фрагментов больших размеров.
Для ДНК-метилтрансфераз эукариот характерна только специфичность 5шС. Метилирование ДНК происходит редко у био-
логических видов, размер генома которых < 108 п.о., и оно повсеместно распространено у организмов таксономических групп с большим размером генома. Метилтрансфераза животных DnmiX (DNA methyltransferase 1) относится к так называемым поддерживающим метилтрансферазам, которые обладают слабой активностью на полностью неметилированной ДНК, и высокой - если в сайте метилирована одна цепь. В этом случае метилирование ДНК ассоциировано с хроматином, неактивным в отношении транскрипции. Также, как и системы рестрикции-модификации у бактерий, метилтрансферазы животных и растений, по-видимому, выполняют защитные функции - инактивируют последовательности, транскрипция которых нежелательна, например многочисленных ретроэлементов. По непонятным причинам системы рестрикции-модификации ДНК у эукариот отсутствуют.
