Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
стимулировали ее в два-три раза у гибридных ферментов, созданных на основе температуро-чувствительных мутантов.
Методами белковой инженерии можно оказывать влияние и на аллостерическую регуляцию в сложных мутильтимерных комплексах. Известно, что с помощью замены единственного а.о. в полипептидной цепи L-лактатдегидрогеназы (ЛДГ) можно изменить ее субстратную специфичность, превратив в малатдегид-рогеназу (МДГ) [185]. Оба фермента являются тетрамерами, построенными из идентичных субъединиц. При этом полученная направленным мутагенезом МДГ в отличие от исходной ЛДГ утрачивает способность взаимодействовать с оксаматом (неметабо-лизируемым аналогом пировиноградной кислоты). Оказалось, что оксамат стимулирует активность МДГ в гибридных гетеротетрамерах, составленных из субъединиц ЛДГ и МДГ, взаимодействуя с субъединицами ЛДГ. Следовательно в такой системе оксамат ведет себя как настоящий аллостерический эффектор.
Приведенные примеры иллюстрируют первые шаги, сделанные на пути конструирования ферментов с аллостерическими свойствами. Полученные результаты показывают потенциальную плодотворность данного направления исследований. Однако для наиболее полного воплощения этих идей в жизнь при конструировании таких полипептидов необходимо учитывать пространственные особенности взаимодействия объединяемых каталитических доменов в гибридных белках, а это невозможно без понимания связей между первичной и пространственной структурами изучаемых полипептидов, что, впрочем, относится и ко всей области рационального дизайна белковых молекул. Интенсивные структурные исследования белков с высоким разрешением и молекулярное моделирование в конце концов позволят решать такого рода проблемы.
3.2.2. Зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и его аналоги
в качестве белков-репортеров
В исследовательской работе часто требуется оценивать скорость биосинтеза и содержание конкретных белковых молекул в живой клетке, следить за их перемещением во внутриклеточном пространстве или выделять труднодоступные белки в индивидуальном виде из сложной смеси. В этом случае белки-репортеры оказываются незаменимыми. Например, присоединив к С-концу анализируемого белка в качестве белка-репортера (3-галактози-дазу, можно производить очистку рекомбинантного белка по активности (3-галактозидазы или отслеживая ее антигенные детер-
минанты иммунохимическими методами. Соединив фрагменты ДНК, содержащие открытые рамки считывания (ОРС), с генами белков-репортеров, получают возможность очистить такие гибридные белки по активности белка-репортера и использовать их для иммунизации лабораторных животных. Антитела далее можно применить для очистки нативного белка, в состав которого входит кодируемый ОРС, рекомбинантный полипептид, и тем самым идентифицировать клонированный фрагмент гена.
Кроме активного использования в изучении экспрессии генов, белки-репортеры оказываются незаменимыми помощниками при исследовании, в частности, факторов транскрипции и механизмов передачи сигналов, при поиске новых лекарственных препаратов и конструировании биосенсоров на основе клеток. В принципе, многие ферменты могут быть использованы в качестве репортеров, и их выбор определяется конкретными задачами и возможностями исследователя. Основными критериями выбора являются удобство идентификации белка-репор-тера в составе молекулярной химеры, его стабильность и другие важные качества. К таким свойствам можно также отнести безопасность в отношении окружающей среды, простоту использования, высокую чувствительность при обнаружении и низкую фоновую активность.
Кроме вышеупомянутой (3-галактозидазы в качестве белков-репортеров в настоящее время интенсивно используются и другие природные или генетически модифицированные белки, включая хлорамфениколацетилтрансферазу, различные флуоресцирующие белки, например, люциферазу светлячков, обелин, экворин, а также зеленый флуоресцирующий белок (GFP) и его аналоги. Флуоресцирующие белки, т.е. белки, способные испускать свет в результате контакта с электромагнитным излучением, в последнее время получили очень широкое распространение. Поэтому некоторые их свойства и области их применения будут кратко рассмотрены ниже.
Биолюминесценция. Некоторые живые организмы обладают способностью светиться, испуская электромагнитное излучение в видимой части спектра. Биолюминесценцией называют образование видимого света в результате химической реакции, протекающей в живом организме. Этот важный биологический феномен используется организмами для защиты от внешних врагов, при половом размножении и в целях маскировки. В настоящее время описано более 30 различных биолюминесцентных систем у бактерий, грибов, червей, ракообразных, насекомых и рыб [186]. Во всех этих системах, как и в случае с рассмотренным экворином,
Примеры биолюминесцентных систем различных организмов
Организм (таксон) Люциферин и другие кофакторы ^макс’
Бактерии (фотобактерии; FMNH2; RCHO 495-500
Vibrio)
