Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Ферменты, солюбилизированные в органических растворителях, содержащих небольшое количество воды или анионных детергентов, способны совершать правильный фолдинг. Следовательно, вода не является единственной уникальной средой, ко-
торая обеспечивает внутримолекулярные взаимодействия, необходимые для приобретения ферментом пространственной структуры, нужной для появления его каталитической активности. Уровень протонирования молекул фермента в органических растворителях обычно задается значениями pH водного раствора, из которого производится их высушивание. Этот феномен получил название pH-памяти белков. Вообще лиофилизация белков мало сказывается на ионизации их заряженных функциональных групп, которая изначально имела место в водных растворах.
Как следует из вышеизложенного, для проявления ферментами максимальной активности в органических средах, требуется проведение предварительной подготовки их препаратов, в частности кристаллизации или высушивания. Другим распространенным приемом является иммобилизация белков, т.е. ковалентное или нековалентное их присоединение к растворимым или нерастворимым носителям. Интересной новой разработкой в этом направлении было создание так называемых пластиковых биокатализаторов (biocatalytic plastics) [157,158]. Пластиковые биокатализаторы получают непосредственно в неводной среде путем сополимеризации виниловых мономеров с химически модифицированными ферментами, растворимыми в органических растворителях, и имеющими на своей поверхности ковалентно присоединенные функциональные группы с полимеризующимися двойными связями. При использовании субтилизина Carlsberg и а-хи-мотрипсин в качестве модельных объектов, было показано, что ферменты полностью сохраняют свою исходную активность в гексане в течение, по крайней мере, трех недель. Технологии на основе биоинкапсуляции в синтетические полимеры, по-видимо-му, найдут широкое применение в органической химии и биотехнологии [159]. Необходимость дегидратации ферментов перед использованием в безводных средах часто является причиной их низкой активности. Предварительная же иммобилизация ферментов, например, на силикагеле, с последующей дегидратацией абсолютным н-пропанолом позволяет в несколько десятков раз повысить их активность в органических растворителях [160].
Многие ферменты быстро инактивируются при высоких концентрациях органических растворителей, которые требуются для проведения соответствующих реакций. Одним из способов, успешно применяемых для решения этой проблемы, является получение комплексов ферментов с липидами или детергентами, что делает их растворимыми и стабилизирует в неводных средах. Например, различные (3-галактозидазы в комплексе с липидами приобретают способность катализировать реакции трансглико-
зилирования с разными гидрофобными спиртами в безводном ди-изопропиловом эфире [161]. Аналогичный подход был успешно применен и к другим гликозидазам [162]. Еще одним современным методом стабилизации ферментов в органических растворителях является молекулярный импринтинг. Поскольку применение этого подхода не ограничивается решением задач такого рода и распространяется на контроль субстратной специфичности белков и ферментов, а также активно используется в других приложениях белковой инженерии и биотехнологии, представляется целесообразным рассмотреть его более подробно.
3.1.3. Молекулярный импринтинг
Феномен молекулярного импринтинга был впервые обнаружен в 1972 г. Для его реализации в водном растворе получают ма-кромолекулярные комплексы низкомолекулярных лигандов с полимерами, которые далее высушивают и промывают растворителем, избирательно освобождающим комплексы от лиганда, но не растворяющим макромолекулы [163]. Поскольку подвижность макромолекул в твердой фазе ограничена, они сохраняют конформацию, которая была индуцирована в них соответствующим лигандом, даже после его удаления из комплекса. В итоге образуется новый класс искусственных материалов, обладающих свойствами специфических рецепторов, поскольку заключают в себе отпечаток пространственной структуры лиганда-матрицы. Такие материалы обладают высоким сродством и избирательностью по отношению к лигандам, уникальной стабильностью, значительно превышающей таковую природных биоматериалов, и их довольно просто получать в большом количестве. Они активно внедряются в практику для синтеза, разделения, идентификации и связывания матричных лигандов и их производных, а также создания биосенсоров. Лигандами же могут служить микроорганизмы, белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, сахара, алкалоиды, стероидные соединения, токсины, гербициды, ароматические и гетероциклические химические соединения, ионы металлов и вещества в газообразной фазе.
Работы по применению молекулярного импринтинга в белковой инженерии начались после того, как двумя группами исследователей в Японии и Великобритании была продемонстрирована возможность с помощью аналогов субстратов в переходном состоянии придать ферментативную активность белкам, у которых она отсутствует - альбумину и лактоглобулину [164,165]. Вскоре молекулярный импринтинг был использован и для контроля суб-
