Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
инженерных конструкциях, применяемых для исследования экспрессии генов в живых тканях in vivo.
GFP-подобные белки. В последнее время начинают получать широкое применение GFP-подобные белки кораллов класса Anthozoa, гены которых впервые были клонированы и экспрессированы в группе С.А. Лукьянова в Институте биооргани-ческой химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва) [194]. Такие GFP-подобные белки образуют семейство полипептидов с молекулярной массой 25-30 кДа, флуоресцирующих в зеленой (GFP), желтой (YFP) и красной (RFP) областях спектра, а также не обладающих способностью к флуоресценции (nonfluorescent chromoproteins - СР). Введение в практику GFP-подобных белков и мутантных форм GFP позволяет использовать в исследованиях феномен биофлуоресценции бел-ков-репортеров в широкой области спектра - 442-645 нм. GFP-подобные белки так же, как и GFP, формируют хромофорную группу из аминокислотных остатков своих полипептидных цепей и не требуют для этого никаких дополнительных кофакторов кроме молекулярного кислорода. В общей сложности у флуоресцирующих белков в настоящее время известно, по крайней мере, четыре типа хромофорных групп, различающихся по своей структуре, что, наряду с эффектами разных внутримолекулярных взаимодействий хромофоров и окружающих аминокислотных остатков, объясняет спектральное разнообразие свойств этих макромолекул.
Введение мутаций в гены GFP-подобных белков позволяет изменять максимумы испускания и квантовый выход исходных макромолекул, в том числе, создавать двухцветные белки с двумя максимумами испускания. Кроме того, удается получать из нефлуоресцирующего СР полипептиды, которые испускают кванты света в дальней красной области спектра, что само по себе, по-видимому, не является пределом возможностей подходов, основанных на мутагенезе генов GFP-подобных белков. Одним из особо примечательных мутантов красного флуоресцирующего белка RFP, известного под коммерческим названием dsRed, является белок dsRed-E5, который изменяет свой цвет с зеленого на красный во времени, что отражает процесс формирования его хромофора и происходит в результате резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) между рано созревающим (5-6 ч после индукции экспрессии) и поздно созревающим (> 9 ч) мономерами в тетрамере dsRed-E5. Это позволяет использовать мутант в качестве своеобразного флуоресцентного хронометра (fluorescent timer) в клеточной биологии.
Одной из серьезных проблем, ограничивающих применение GFP-подобных белков Anthozoa является олигмеризация в физиологических условиях. Это не мешает их использованию в качестве простых репортеров экспрессии генов, но превращается в серьезное ограничение при получении гибридных белков особенно в том случае, когда исследуемый белок сам существует в виде олигомера. В этом случае производные dsRed, как правило, образуют внутриклеточные агрегаты. Решение этой проблемы может лежать на пути создания мутантов dsRed с нарушенной олигомеризацией. К преимуществам белков этого семейства следует отнести низкую аутофлуоресценцию в красной области спектра, и возможность раздельной детекции их флуоресценции и флуоресценции GFP (в том числе его производных), что допускает многоцветное окрашивание биологических объектов.
Использование экворина, GFP и GFP-подобных белков в искусственных генетических системах. Благодаря своим уникальным свойствам экворин активно используется в качестве флуоресцентной метки в иммуноферментных методах, в зондах на основе нуклеиновых кислот, а также в высокочувствительных системах количественного определения содержания универсального вторичного мессенджера Са2+ внутри клеток. Изменение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме и ее микрокомпартментах часто сопровождает стимуляцию внеклеточных рецепторов, принадлежащих к обширному классу рецепторов, сопряженных с G-белками. Эти рецепторы активируются в ответ на многочисленные внеклеточные стимулы, включая воздействия светом, нейромедиаторами, гормонами и веществами, имеющими запах. В последнее время в исследованиях по функциональной геномике открывается большое количество новых рецепторов, для которых, как правило, неизвестны эндогенные лиганды [191]. Кроме того, оценивать уровень активации этих рецепторов необходимо при разработке новых лекарственных препаратов, специфически взаимодействующих с нкми. Для решения таких задач были разработаны автоматизированные высокочувствительные методы оценки активности рецепторов с использованием экворина в качестве белка-репортера [192].
На основе экворина были созданы клеточные микросенсоры для быстрого обнаружения патогенных вирусов и бактерий. Для этой цели генно-инженерными методами были получены В-клеточные линии, экспрессирующие на своей поверхности молекулы разных иммуноглобулинов, специфичных в отношении конкретных возбудителей, а также апоэкворин. Взаимодействие иммуноглобулинов с лигандами запускает внутриклеточный каскад
передачи сигналов, приводящих к освобождению ионов Са2+, и, как следствие, люминесценции экворина. Клетки иммобилизовали на стеклянной подложке фотолитографическим методом, которую помещали в небольшую проточную камеру, содержащую питательную среду. Процесс обнаружения возбудителей в такой системе занимает менее одной минуты.
