Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
бинантный ген интегрировали в локус URA3 хромосомы дрожжей. Обе плазмиды были введены в клетки данного штамма дрожжей, после чего в них определяли активность (3-галактози-дазы стандартным калориметрическим методом. В контрольных экспериментах было показано, что ни домены сами по себе, ни каждый из химерных белков по отдельности не активировали транскрипцию гена-репортера. Однако одновременное присутствие в клетках дрожжей двух плазмид сопровождалось 200-кратным возрастанием внутриклеточной активности (3-галактозида-
зы. Нативный фактор транскрипции Gal4 стимулировал экспрессию этого гена в 4000 раз.
Плазмиды, использованные в экспериментах, содержали последовательности нуклеотидов, кодирующие домены AD и DBD, были фланкированы последовательностями полилинкера и находились под контролем промотора гена алкогольдегидрогеназы ADH1, конститутивного промотора промежуточной силы. Обе плазмиды относятся к семейству челночных векторов, которые способны реплицироваться как в клетках дрожжей, так и Е. coli. Репликацию в бактериальных клетках обеспечивает область начала репликации ori pBR, а ген устойчивости к ампициллину Ыа выполняет функции селектируемого маркера. В дрожжевых клетках функционирует область начала репликации CEN4, обеспечивая поддержание плазмиды в клетках в виде 1-5 копий. В этом случае в качестве селектируемых маркеров используются гены TRP1 и LEU2, которые дают возможность ауксотрофным мутантам дрожжевых клеток расти без добавления аминокислот Тгр и Leu в питательную среду.
Во время функционирования системы Y2H в клетках дрожжей одновременно присутствуют три плазмиды, включая две, рассмотренные выше, и плазмиду, содержащую ген-репортер. В этой связи возникает проблема очистки одной из трех плазмид, кодирующих исследуемый белок для ее дальнейшего использования в секвенировании данного гена, а также в новых раундах мутагенеза и отбора мутантных белков. Для решения этой задачи во все плазмиды, кроме отбираемой, вводят контр-селективные маркеры, например, ген URA3, кодирующий оротидин-5’-фос-фат-декарбоксилазу [122]. Этот жизненно важный фермент участвует в биосинтезе урацила, но, кроме того, он обладает способностью превращать нетоксичную 5-фтороротовую кислоту (5-FOA) в токсичный 5-фторурацил. Таким образом, экспрессия гена URA3 детальна для клеток дрожжей, выращиваемых в присутствии 5-FOA. Альтернативно плазмидами, выделенными из дрожжевых клеток, трансформируют ауксотрофные клетки Е. coli trpl~, 1еи2~, и трансформанты высевают на селективную среду, в которой отсутствуют соответствующие аминокислоты. В результате вырастают клетки, содержащие плазмиду с генами TRP1 и LEU2. Кроме того, в отбираемую плазмиду могут быть введены и другие селектируемые маркеры, которых нет в других плазмидах, например, гены устойчивости к антибиотикам, в частности, к зеоцину 0zeor).
В дополнение к системе Y2H, основанной на DBD- и AD-до-менах белка Gal4, разработано несколько систем, использующих
другие активирующие и ДНК-связывающие домены. Среди них наиболее известны системы на основе DBD LexA-penpeccopa Е. coli и AD белка VP16 вируса простого герпеса [123], а также DBD репрессора cl фага X [124] и эстрогенового рецептора человека [125].
Гены-репортеры в системе Y2H. Кроме приложений в стандартных исследованиях белок-белковых взаимодействий, система Y2H может быть эффективно использована в направленной эволюции белков для отбора мутантов, взаимодействующих с изучаемыми лигандами. В этом случае, удобство системы заключается в том, что интенсивность отбора эволюционирующих белков может быть регулируема. Так, на ранних этапах отбора, когда необходимо обнаруживать белки, обладающие небольшой активностью, используются высоко чувствительные системы ге-нов-репортеров. Для выявления более активных мутантов следующего поколения силу отбора постепенно понижают, применяя менее селективные гены.
Современные системы Y2H обеспечивают три уровня контроля отбора благодаря последовательностям нуклеотидов трех типов: вышерасположенных активирующих последовательностей UAS (upstream activating sequences), промотора и самого гена-репортера, которые в разных комбинациях присутствуют в соответствующих плазмидах. Первый уровень контроля достигается с помощью UAS. Такие последовательности специфически распознаются DBD-доменами белков-активаторов транскрипции и служат местом взаимодействия комплекса DBD-AD с ДНК в окрестностях гена-репортера. При этом уровень активации транскрипции коррелирует с числом DBD-связывающих сайтов, расположенных перед промотором, количество которых в генно-инженерных конструкциях может варьировать от одного до четырех [126]. Например, DBD LexA202 взаимодействует с соответствующей UAS в виде гомодимера, и наиболее чувствительные генно-инженерные конструкции содержат восемь тандемно расположенных последовательностей операторов LexA. Конечно, необходимо иметь в виду, что чем чувствительнее система с геном-репортером, тем большее количество ложноположительных результатов будет в ней фиксироваться.
