Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
ла, й электрофорез во втором направлении также ведется до исчерпания антигенов в первоначальных зонах разделения, т. е. до прекращения увеличения высоты всех пиков. Чем больше содержание данного антигена в смеси, тем выше его пик, но эта высота зависит и от содержания специфических для него антител в антисыворотке. Чем их больше, тем пик ниже, а обрисовывающая его линия преципитации интенсивнее.
Внимательно изучив топологию такой «горной страны» (см. рис. 38), можно не только обнаружить и идентифицировать множество антигенов, но и оценить соотношение их количеств в исследуемом препарате путем измерения площадей пиков. Способы идентификации отдельных пиков описаны ниже. Что же ка-сается количественных оценок, то они, конечно, носят лишь ориентировочный характер, поскольку, как только что было отмечено, площадь и высота каждого пика зависят не только от содержания данного антигена в препарате, но и от концентрации специфических для него антител в антисыворотке. Однако методч
Рис, 38, Пики преципитации после перекрестного иммуноэлектрофореза белков; сыворотки крови человека
Препарат — 2 мкл неразбавленной сыворотки; электрофорез — 1,5 ч при напряженности-поля 10 Б/см и 10°; иммуноэлектрофорез — в течение ночи при напряженности 2 В/см,
Рис. 39. Шаблон для вырезания геля первого направления в методе перекрестного иммуноэлектрофореза
Рис, 40. Перенос полосы геля первого направления после электрофореза на пластину для заливки геля второго направления
безупречен при использовании его для обнаружения отклонения пропорций антигенов от некоторой нормы, например для выявления патологических изменений белкового состава крови или других физиологических жидкостей. В этом случае для сравнения используют одну и ту же иммунную полиспецифическую антисыворотку и картину распределения пиков для исследуемого препарата сопоставляют с распределением для нормального контрольного образца.
Технические приемы, используемые в рассматриваемом методе, связаны с необходимостью формирования составного геля. Электрофорез в первом направлении должен проходить в геле без антител. Переход ко второму направлению — это переход молекул антигенов под действием поля в гель агарозы, смешан* ной с антисывороткой. Здесь, в частности, возникает проблема надежного контакта между двумя гелями. При этом второй гель приходится формировать после окончания фракционирования антигенов в первом геле во избежание диффузии антител в него во время электрофореза.
Практически поступают следующим образом. С помощью специального шаблона с отверстиями и прорезями в пластине геля первого направления вырезают лунки для исходных препаратов и разрезают ее на полосы в направлении электрофореза. На рис. 39 изображен такой шаблон, предназначенный для одновременного электрофореза трех препаратов. Наличие двух отверстий для каждой полосы геля имеет отношение к описанному ниже методу идентификации антигенов. Здесь пока используется по одному отверстию в каждой полосе. Электрофорез проводят в тех же условиях, что были описаны для метода иммуноэлектрофореза по Грабар и Уильямс.
По окончании электрофореза с помощью тонкой, заточенной с одной стороны металлической пластинки отделяют каждую
полосу и переносят ее на край другой стеклянной пластины (рис. 40), Остальную часть этой пластины заливают расплавленной смесью 1%-ной агарозы с антисывороткой, так чтобы новый слой геля имел такую же толщину, как полоса первого направления, и сплавился в ней в один сплошной слой. Здесь надо иметь в виду те же соображения о необходимости надежного сцепления геля с подложкой, какие были высказаны при описании метода «ракет Лорелла». Двуслойную пластину снова устанавливают в прибор для горизонтального электрофореза, повернув ее на 90°. Катодный фитиль накладывают вдоль наружного края полосы геля первого направления. Теперь в ходе электрофореза разделившиеся антигены переходят в гель агарозы с антисывороткой и образуют в нем пики преципитатов,, как было описано выше. Далее следует, как обычно, отмывка от непреципитировавших белков, сушка и окрашивание геля.
В качестве примера процитируем недавнюю работу, посвященную исследованию мембранных белков тромбоцитов человека [Shulman, Karpatkin, 1980]. В первом направлении электрофорез вели в 1%-ном геле агарозы, растворенной в буфере, содержавшем 0,02 М веронала и 0,07 М Триса (pH 8,6). Для улучшения растворимости мембранных белков в буфер добавляли 1 % Тритона Х-100. Слой геля толщиной 1,3 мм формировали на стеклянной пластинке размером 5x5 см. В лунку диаметром 5 мм вносили 50 мкг белкового препарата,, растворенного в 20 мкл того же буфера. Электрофорез при напряжении 150 R занимал около 2,5 ч. Затем вырезали полоску шириной 1,2 см, переносили ее на точно такую же стеклянную пластинку и заливали в качестве геля второго направления 1%-ный раствор агарозы, содержавший 6% (по объему) антисыворотки с концентрацией белка 2 мг/мл. Электрофорез во втором направлении вели в течение 18 ч при напряжении 55 В. Гель агарозы отжимали и одновременно промывали 6—8 раз 0,1 М раствором NaCI, сушили на воздухе и окра* шивали 0,25%-ным раствором СВВ R-250 в смеси, содержащей 9% СНзСООН и 45% этанола.
