Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Глава 3
ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПО ГРАБАР И УИЛЬЯМС
В рассмотренном методе обнаружения антигенов после электрофореза в ПААГ путем их диффузии в слой агарозы иммунная реакция следовала за окончанием этой диффузии, когда снятую с ПААГ агарозную реплику вымачивали в специфической антисыворотке. Два процесса можно совместить во времени, если антисыворотку заставить диффундировать в гель навстречу диффузии антигена из белковых зон, полученных в результате электрофореза [Grabar, Williams, 1953]. При этом можно ожидать образования полос преципитации комплексов антиген — антитело, подобно тому как это имеет место при двойной радиальной иммунодиффузии по методу Ухтерлони. Для удобства наблюдения раствор антисыворотки следует заливать не сверху, а рядом с треком электрофореза, на некотором расстоянии от него, с тем чтобы оставалась свободная полоса ПААГ, где и будет происходить диффузия антигенов и антител навстречу друг другу. Поскольку расположение полос антигенов после электрофореза заранее неизвестно, антисыворотку, очевидно, придется заливать не в лунку, а в канавку, идущую вдоль всего трека. Кроме того, антисыворотку следует вносить в такую канавку только после окончания электрофореза, иначе преждевременная диффузия антител в гель может помешать завершению процесса электрофоретического фракционирования смеси белков.
Для ускорения диффузии электрофорез предпочитают вести в геле агарозы или агара. При анализе одного препарата можно воспользоваться предметным стеклом; для одновременного электрофореза трех — пяти препаратов (это удобно при подборе исходного разбавления белкового препарата и антисыворотки) используют квадратные стеклянные пластинки. Фирма «LKB» поставляет для этой цели пластинки размером 84X94мм.
На горизонтально расположенную пластинку выливают расчетный объем расплавленного 1%-ного раствора агарозы (или 2%-ного агара) в 0,05—0,075 М Na-барбнтуратном буфере (pH 8,6), так чтобы образовать слой геля толщиной 1—1,5 мм. Заготовленные впрок пластины можно хранить во влажной ка-
мере. Выбор pH здесь диктуется не только условиями электрофореза, но и оптимизацией условий иммунной реакции. Препарат обычно вносят в цилиндрическую лунку диаметром 2—4 мм. Такая форма лунки удобнее, чем прямоугольный колодец, для последующего процесса формирования дуг преципитации. Лунку располагают на расстоянии 2—3 см от катодного края пластины геля. Это расстояние обеспечивает формирование дуг преципитации (см. ниже) для антигенов, слабо мигрирующих в направлении анода, а также необходимо для компенсации «катодного дрейфа» всей картины фракционирования за счет эндосмоса (см. часть I). Эндосмос здесь не так опасен, как при ИЭФ. Достаточно, чтобы он был умеренным (—тг^0,1), но учитывать его надо; в случае значительного эндосмоса следует расположить лунку дальше от края пластины. Эндосмос в агаре всегда выше, чем в агарозе.
Если есть опасение, что некоторые белки, особенно щелочные, при pH 8,6 окажутся заряженными положительно и при электрофорезе будут мигрировать к катоду, то лунку препарата следует еще отодвинуть от края пластины. После окончания электрофореза, особенно если его ведут в агаре, нередко оказывается, что некоторые белковые зоны и соответствующие им дуги преципитации (см. ниже) располагаются со стороны катода по отношению к лунке; чаще это бывает не за счет положительных зарядов соответствующих белков, а в результате эндосмоса. Среди белков крови наиболее расположены к смещению в сторону катода иммуноглобулины, слабее других мигрирующие под действием электрического поля.
Для вырезания лунок используют такие же трубочки-штампы с отсосом геля, как и в методе Ухтерлони. В продаже имеются специальные телескопические трубочки-штампы для этой цели. Их присоединяют к водоструйному насосу. При вдавливании в гель сначала внутренняя трубочка с острыми краями вырезает лунку. Потом наружная трубка, которую в верхнем положении удерживает пружинка, опускается, перекрывает находящееся внизу отверстие, связывающее полость внутренней трубочки с атмосферой, и вырезанный гель отсасывается. Такое устройство несложно изготовить в лабораторной мастерской.
Одновременно с приготовлением лунок прорезают скальпелем продольные стороны канавок для антисыворотки, так чтобы ближайшая к будущему треку белков сторона канавки была от него на расстоянии 5—10 мм. Ширина канавки составляет 2— 3 мм. До окончания электрофореза гель из канавки лучше не удалять в интересах сохранения однородности электрического поля во время электрофореза. Лунки и канавки удобно вырезать по шаблону из плексигласа (рис. 32). Показанные на шаблоне три отверстия в каждом треке предусмотрены для обоснованного выше выбора положения лунки для препарата. Использование шаблона позволяет обеспечить стандартность исходного положения лунок и ориентации канавок, что существенно для со-
поставления результатов параллельных экспериментов. Шаблон лучше класть не на гель, а с некоторым зазором на специальные уступы плоской формы, в которую, фиксированно по размеру, укладывают пластину с гелем. Фирма «LKB» для своих стандартных пластин поставляет такие формы и набор разнообразных шаблонов к ним.
